参麝活络丸对脑缺血再灌注损伤大鼠脑神经元凋亡的影响

赵丽华 莲花 康晓娜 乌兰图雅

脑是人体对缺氧最为敏感的器官，短期不完全性缺血只引起可逆性损害，而长时间的完全缺血或严重缺血会引起梗死，最明显的组织学变化是脑水肿及脑细胞坏死。脑缺血-再灌注可造成脑功能严重受损。参麝活络丸是由大活络丸加减变化而成，由麝香、红参、熟地黄、乌梢蛇(制)、羌活、全蝎、当归、蕲蛇(制)、茯苓、两头尖、白术(炒)、草乌(制)等中药组成，其功效为舒筋活络，祛风豁痰。临床可用于治疗脑缺血性中风后遗症。临床人拟用量为4 g生药/d(0.058 g生药·kg-1·d-1，按70 kg体重计算)。本文对该剂进行了与功能主治有关的主要药效学试验。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，体重180～200 g，由内蒙古医科大学实验动物中心提供[许可证号：SCXK(蒙)2016-0001]。大鼠于实验动物屏障系统内饲养，室温20～25℃，光照时间08∶00～20∶00。实验过程遵循中华人民共和国科技部《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 主要试剂与仪器 (1)药物参麝活络丸：口服，1丸/次，3次/d，规格：3 g/丸，1 g颗粒含0.45 g生药(湖北明和药业有限公司，批号：20160421)。尼莫地平片：口服，1～2片/次，3次/d；规格：30 mg(拜耳医药保健有限公司，批号：BJ33125)。(2)试剂甲苯胺蓝：批号528A027，北京Solarbio科技有限公司。青霉素:华北制药股份有限公司，批号：F7038619。多聚甲醛:批号：F20161203,国药集团化学试剂有限公司。TMS-P超敏试剂盒:批号：1612031406，福建迈新生物技术开发有限公司。PBS磷酸缓冲液:批号：20160722，北京Solarbio科技有限公司。枸橼酸钠:枸橼酸国药集团化学试剂有限公司。细胞色素C、Apaf1、Caspase-9、Caspase-3，博士德生物。DAB显色试剂盒:福建迈新生物技术开发有限公司。水合氯醛：北京市旭东化工厂，批号20000530。(3)仪器电热恒温培养箱:厦门医疗电子仪器厂。Nikon130285型光电显微镜。数字式pH值计:上海日岛科学仪器有限公司。YG-280型烤片机：阳光神琦医用科技有限公司。ZA120R4型万分之一天平:上海赞维衡器有限公司。YG-280KX摊片机:湖北孝感市阳光神琦医用科技有限公司。Leica切片机:德国(徕卡)生产。

1.3 动物分组 60只SPF级SD大鼠按体重分为假手术组、模型组、参麝活络丸低剂量组(0.37 g生药/kg)、参麝活络丸中剂量组(0.74 g生药/kg)、参麝活络丸高剂量组(1.48 g生药/kg)、尼莫地平片组(8.10 mg/kg)，每组10只。

1.4 模型制备 采用改良Zea-Longa线栓法造成大鼠脑缺血再灌注损伤模型。先用水合氯醛(10%)腹腔注射充分麻醉，给药体积为3.5 ml/kg，分离并结扎颈总动脉和颈外动脉。从颈外动脉刺插入栓线,将栓线向内插入(18.0±2.0)mm,于分叉处结扎，缺血100 min 后，将栓线抽离，涂青霉素粉后缝合皮肤，制备脑缺血再灌注损伤模型。假手术组切开颈部皮肤,线栓插入颈动脉，但未深入到脑中动脉[1,2]。

1.5 给药方案 参麝活络丸低剂量组(0.37 g生药/kg)、参麝活络丸中剂量组(0.74 g生药/kg)、参麝活络丸高剂量组(1.48 g生药/kg)、尼莫地平片组(8.1 mg/kg)，给药体积为10 ml/kg，1次/d，连续7 d，假手术组和模型组灌胃等体积蒸水10 ml/kg。

1.6 观察指标及方法

1.6.1 神经功能评分方法:实验结束后以空白大鼠行为学参考对各组大鼠进行神经功能评分，Bederson的神经行为学评价标准：无神经功能缺损症状，0分；提尾时对侧肢体屈曲内收，1分；一侧推抵抗力下降，2分；自由活动时向瘫疾侧划圈，3分；意识丧失4分[3]。

1.6.2 取材及尼氏染色:神经功能评分后，各组大鼠用水合氯醛(10%)腹腔注射充分麻醉，给药体积为3.5 ml/kg，开腹暴露心脏，灌注针刺入左心室，右心耳剪一小孔，先用0.9%氯化钠溶液冲洗，至肝脏变白，再用4%多聚甲醛固定液(0.01 mol/L PBS配制，pH值7.4)灌流固定。断头开颅取脑将视交叉平面前后2～5 mm 处冠状切开大脑，取中间部分置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h。固定后的脑组织用酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片。切片进行尼氏染色后[4]，光镜下观察大鼠脑组织神经元形态及尼氏小体改变。

1.6.3 免疫组化检测:按试剂盒说明方法进行免疫组化染色检测大鼠脑组织神经元细胞色素C(Cytochrome-C，cyt-c)、凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating factor-1，Apaf1)、半胱氨酸蛋白酶-9(Cysteine aspartic acid specific protease-9，Caspase-9)、半胱氨酸蛋白酶 -3(Cysteine aspartic acid specific protease-3，Caspase-3)表达，用ImageJ软件对免疫组化切片400倍放大图片进行灰度值分析。积分光密度值IOD计算方法：IOD=log[gv0/gv)]，gv0为背景灰度值，gv为目标区灰度值。

2 结果

2.1 6组大鼠Bederson的神经行为损伤评分比较 治疗前各组与假手术组神经行为损伤评分具有显著性差异(P<0.01)，治疗后模型对照与假手术组神经行为损伤评分差异有统计学意义(P<0.01)。各治疗组比模型对照组神经行为损伤评分均显著降低(P<0.01)。见表1。

表1 6组大鼠Bederson的神经行为损伤评分比较 n=10,分，

注：与空白组比较,*P<0.01；与模型组比较,#P<0.01;自由度(5，54)，F=2 628.65，F=1 072.93

2.2 6组大鼠脑前额叶神经元尼氏染色结果 假手术组脑前额叶神经元清晰，细胞核圆形或椭圆形，核仁清晰，胞浆染色均匀，包浆内可见丰富的尼氏小体；模型组细胞形态不规则，部分神经元胞体皱缩，胞浆内尼氏小体减少，核仁消失。参麝活络丸组及阳性对照组大鼠脑前额叶神经元病理改变减轻，与模型组比较有明显改善。见图1。

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图1 大鼠脑前额叶神经元显微图(尼氏染色×200)；A 假手术组；B 模型组；C 参麝活络丸低剂量组；D 参麝活络丸低剂量组；E 参麝活络丸低剂量组；F 尼莫地平片组

2.3 6组大鼠脑前额叶神经元cyt-c和Apaf1的表达比较 与假手术组比较模型对照组cyt-c、Apaf1表达显著增加(P<0.01)。与模型对照组比较参麝活络丸低剂量组、参麝活络丸中剂量组、参麝活络丸高剂量组cyt-c、Apaf1表达显著性降低。见表2，图2、3。

组别剂量cyt-cApaf1假手术组-0.26±0.030.31±0.04模型对照组-0.47±0.05∗0.54±0.05∗参麝活络丸低剂量组0.37 g/kg0.41±0.06#0.45±0.10△参麝活络丸中剂量组0.74 g/kg0.38±0.07△0.47±0.08△参麝活络丸高剂量组1.48 g/kg0.36±0.10△0.47±0.05#尼莫地平片组8.10 mg/kg0.39±0.07△0.48±0.02△

注：与空白组比较,*P<0.01；与模型组比较,#P<0.05,△P<0.01;自由度(5，54)，F=10.09，F=15.99

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图2 大鼠脑前额叶神经元cyt-c表达显微图(×200)；A 假手术组；B 模型组；C 参麝活络丸低剂量组；D 参麝活络丸中剂量组；E 参麝活络丸高剂量组；F 尼莫地平片组

2.4 6组大鼠脑前额叶神经元Caspase-9、Caspase-3的表达结果比较 与假手术组比较模型对照组Caspase-9表达显著增加(P<0.01)。与模型对照组比较参麝活络丸低剂量组、参麝活络丸中剂量组、参麝活络丸高剂量组Caspase-9表达显著降低。与假手术组比较假手术组Caspase-3表达显著增加(P<0.01)。与模型组比较参麝活络丸中、高剂量组Caspase-3表达显著性降低。见表3，图4、5。

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图3 大鼠脑前额叶神经元Apaf1表达显微图(×200)；A 假手术组；B 模型组；C 参麝活络丸低剂量组；D 参麝活络丸中剂量组；E 参麝活络丸高剂量组；F 尼莫地平片组

组别剂量Caspase-9Caspase-3假手术组-0.22±0.080.19±0.07模型对照组-0.48±0.09∗0.45±0.10∗参麝活络丸低剂量组0.37 g/kg0.40±0.07∗0.37±0.13参麝活络丸中剂量组0.74 g/kg0.35±0.08#0.36±0.10∗参麝活络丸高剂量组1.48 g/kg0.36±0.10#0.33±0.11∗尼莫地平片组8.10 mg/kg0.34±0.09#0.33±0.09∗

注：与空白组比较,*P<0.01；与模型组比较,#P<0.01;自由度(5，54)，F=9.75，F=6.91

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图4 大鼠脑前额叶神经元Caspase-9表达显微图(×200)；A 假手术组；B 模型组；C 参麝活络丸低剂量组；D 参麝活络丸中剂量组；E 参麝活络丸高剂量组；F 尼莫地平片组

3 讨论

脑缺血见于多种神经疾病的病理过程中，如脑血管病、脑肿瘤等。可见头晕或肢体麻木、活动不灵，肢体软弱无力。脑血管病可分为血管壁病变，血液成分改变和血流动力学改变等。正常血管内皮细胞是一层光滑的细胞群，血管内皮细胞功能的损害可使内皮细胞剥离，最终导致动脉粥样硬化的发生，使动脉管腔狭窄，动脉粥样硬化斑块脱落阻塞脑血管，引起脑组织局部动脉血流灌注减少，脑供血不足。血小板极易黏附在病变血管内膜处，释放出多种生物活性物质，加速血小板的再聚集，极易形成动脉附壁血栓[5]。脑梗死会造成局部脑组织缺血、缺氧甚至软化、坏死，进而出现急性脑功能障碍的临床表现征，临床表现为头昏、头晕、肢体偏瘫、偏身感觉减退、大小便失禁、步态不稳、肢体无力，吞咽困难等。治疗前各组比假手术组神经行为损伤评分显著增加，说明本研究已成功复制大鼠缺血再灌注损伤模型。治疗后模型对照组比假手术组神经行为损伤评分显著增加，说明大鼠脑缺血再灌注损伤尚未自然恢复。参麝活络丸各剂量组比模型对照组神经行为损伤评分均显著性降低，说明参麝活络丸对大鼠脑缺血再灌注损伤模型具有显著性的治疗作用[7,8]。

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图5 大鼠脑前额叶神经元Caspase-3表达显微图(×200)；A 假手术组；B 模型组；C 参麝活络丸低剂量组；D 参麝活络丸中剂量组；E 参麝活络丸高剂量组；F 尼莫地平片组

脑缺血再灌注损伤时间越长，兴奋性递质含量越低，脑组织超微结构改变越明显：线粒体肿胀，可见线粒体嵴断裂、核染色质凝集、内质网高度肿胀，结构明显破坏，Nissl体完整性破坏。本研究中假手术组脑前额叶神经元核仁清晰，胞浆染色均匀，包浆内可见丰富的尼氏小体；模型组脑前额叶神经元胞浆内尼氏小体减少，核仁消失。参麝活络丸组大鼠脑前额叶神经元病理改变与模型组相比有明显改善。

细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡参与缺血再灌流所致的神经元损伤，细胞凋亡使梗死区面积扩大[9,10]。通常外源性细胞色素C不能进入健康细胞，但在缺氧时，细胞膜的通透性增加，细胞色素C便有可能进入细胞及线粒体内，增强细胞氧化，能提高氧的利用[11]。脑缺血再灌注损伤时线粒体肿胀，可见线粒体嵴断裂，从线粒体中泄露出的细胞色素C有诱导细胞凋亡的作用[12]。释放到细胞浆的细胞色素C在dATP存在的条件下与凋亡相关因子(Apaf-1)结合形成多聚体，Apaf-1促使caspase-9与其结合形成凋亡小体，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活caspase-3，从而诱导细胞凋亡[13,14]。本研究中参麝活络丸中、高剂量组cyt-c、Apaf1、Caspase-9和Caspase-3表达比模型对照组显著降低，说明参麝活络丸可通过降低cyt-c、Apaf1、Caspase-9和Caspase-3表达而抑制脑缺血再灌注损伤所引起的神经元凋亡，起到对大鼠脑缺血再灌注损伤神经元的保护作用[15]。

参麝活络丸可通过抑制cyt-c、Apaf1、Caspase-9、Caspase-3凋亡通路对脑中动脉阻塞-再灌注损伤模型产生治疗作用，以上药效学结果为参麝活络丸在临床上治疗脑缺血再灌注损伤提供了试验依据。