达原饮中芍药苷和黄芩苷在大鼠体内药动学研究

利 玲，胡 秀，利 莉（1.鄂东医疗集团黄石市中心医院，湖北理工学院附属医院，湖北 黄石 435000；2.肾脏疾病发生与干预湖北省重点实验室，湖北 黄石 435000）

达原饮，又名达原散，由槟榔、厚朴、草果仁、知母、芍药、黄芩、甘草七味中药组方而成[1]。现代多应用于各种发热、盗汗、病毒性脑炎等[2-3]。目前已有多项研究报道采用高效液相色谱法测定达原饮中芍药苷、黄芩苷等有效成分的含量[4-5]，本实验采用高效液相色谱-串联质谱联用（LC-MS/MS）技术建立了同时测定大鼠血浆中芍药苷和黄芩苷浓度的方法，并成功应用于大鼠灌胃达原饮后的芍药苷和黄芩苷药代动力学研究。该方法满足临床前药代动力学研究中对于专属性和线性、准确度和精密度、基质效应和回收率、稳定性的要求，方法灵敏，简便易行，适用于达原饮的药代动力学研究。

1 材料与方法

1.1 仪器

美国Finnigan公司TSQ Quantum Discovery MAX型液质联用系统（LC-MS/MS，美国Finnigan公司）；Eppendorf 5427 R台式高速冷冻离心机（Eppendorf中国有限公司）；XW-80A 旋涡混合器（上海青浦沪西仪器厂）；BS110S型电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；KQ 500DE型数控超声波清洁器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 药物与试剂

芍药苷（纯度：96.4%，批号：110736-201438）购自中国食品药品检定研究院；黄芩苷（纯度：93.3%，批号：110715-201318）购自中国食品药品检定研究院；黄芪甲苷（内标，纯度：93.0%，批号：110781-201515）购自中国食品药品检定研究院；芍药、黄芩、槟榔、厚朴、草果、知母、甘草药材购自湖北蕲州中药材市场；色谱纯甲醇和乙腈购自美国Fisher Scientific公司；水为娃哈哈饮用纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

1.3 动物

6只雄性SD大鼠，体质量（220±20）g，购自北京维通利华动物实验中心，实验动物合格证号：SCXK（京）2014-0016。动物饲养于温度控制在（25±2）℃、湿度控制在40%-60%的环境中，每天交替进行12 h光照，12 h黑暗处理。

1.4 色谱和质谱条件

1.4.1 色谱条件 色谱柱为Inersil ODS柱（4.6 mm×50 mm，5 µm）；流动相采用水-乙腈梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～0.2 min，乙腈保持20%；0.2～1.2 min，乙腈由20%增加到45%；1.2～2.0 min，乙腈由45%增加到80%；2.0～3.0 min，乙腈保持80%；3.0～3.1 min，乙腈由80%变为20%；3.1～5.0 min，乙腈保持20%。柱温设定为35 ℃；进样仓温度控制在10 ℃；流速0.5 mL·min-1；进样量10 µL；分析时间5 min。

1.4.2 质谱条件 采用电喷雾（ESI）离子源，正离子模式，扫描方式为选择离子检测（selective reaction monitoring，SRM），喷雾电压3500 V，雾化温度250 ℃，毛细管温度300 ℃。监测离子对分别为：芍药苷m/z 502.9→m/z 341.0，黄芩苷m/z 469.2→m/z 293.3，黄芪甲苷（内标）m/z 806.9→m/z 626.9；碰撞能分别为26 V、16 V、35 V。

1.5 标准曲线和质控样品的配制

精密称取黄芪甲苷对照品适量，用二甲基亚砜溶解，配制成浓度为5 mg·mL-1的黄芪甲苷储备液，临用时用甲醇稀释成黄芪甲苷浓度为1000 ng·mL-1的内标工作溶液。

精密称取芍药苷和黄芩苷对照品适量，分别用甲醇溶解，并配制成浓度均为10 mg·mL-1的储备液。临用前将两个储备液等体积混合，用甲醇逐级稀释，配制成浓度为50、250、2000、10 000、15 000、20 000 ng·mL-1的混合系列标准溶液。将空白大鼠血浆与混合系列标准溶液按照体积比90∶10混合，使得大鼠血浆中的芍药苷和黄芩苷系列浓度均为5、25、200、1000、1500、2000 ng·mL-1。质控样品（quality control，QC）按照同样方法配制，大鼠血浆中芍药苷和黄芩苷的浓度均为10、800、1600 ng·mL-1。

1.6 血浆样品处理

采用有机溶剂直接沉淀法处理大鼠血浆样品。取100 µL大鼠血浆样品，加入300 µL内标工作溶液，涡旋振荡60 s，充分混合后，于14 000 r·min-1转速离心10 min，分离上清液加入样品瓶，进样10 µL进行LC-MS/MS分析。标准曲线和质控样品也采用同样方法进行处理。

1.7 大鼠药动学实验

6只雄性SD大鼠适应性饲养7 d，实验前1天至少禁食12 h，不禁水，达原饮按照10 g·kg-1的剂量[5-7]（相当于芍药苷11 mg·kg-1，黄芩苷64 mg·kg-1）灌胃给予大鼠，分别于给药前和给药后5、15、30、60、120、240、360、480、720 min于大鼠眼球静脉丛取血250 µL置于肝素化的离心管中，以3500 r·min-1的转速离心15 min，分离上层血浆于-20 ℃保存待测[8-11]。

1.8 数据处理

计数资料以（平均值±标准差）表示，芍药苷和黄芩苷的主要药代动力学参数采用DAS 2.0软件进行计算。

2 结果

2.1 方法学验证

2.1.1 专属性 采用大鼠空白血浆样品、大鼠空白血浆加入被测物标准液和内标的样品、大鼠给药1 h后血浆样品进行处理进样，得到大鼠血浆中被测物和内标的典型色谱图，见图1。显示血浆中内源性物质不干扰被测物和内标的测定，且被测物和内标之间的分离度良好。芍药苷、黄芩苷和内标的出峰时间分别为1.91 min、3.08 min、3.69 min，出峰位置无干扰，方法的专属性良好。

2.1.2 标准曲线和定量限 采用加权最小二乘法计算标准曲线方程，以被测物与内标黄芪甲苷的峰面积比值为Y，以被测物的质量浓度为X，得到芍药苷的回归方程为Y = 5.148×10-4X-2.6148×10-3，权重因子W = 1/X2，相关系数r2= 0.995 1；黄芩苷的回归方程为Y = 6.613×10-4X + 1.863 2×10-3，权重因子W = 1/X2，相关系数r2= 0.996 5。芍药苷和黄芩苷的定量下限均为5 ng·mL-1，连续进样6次，被测物准确度在80%-120%范围内，精密度（RSD）小于20%，参照《药物非临床药代动力学研究技术指导原则》，该结果符合生物样品测试要求。

图1 大鼠血浆特征色谱图A-大鼠空白血浆样品，B -大鼠空白血浆加入被测物和内标，C-大鼠给药1 h后血浆样品；1-黄芩苷，2-芍药苷，3-黄芪甲苷（内标）Fig 1 Chromatograms of rat plasmaA-blank plasma sample of rats, B-blank plasma sample of rats spiked with analytes and IS, C-plasma sample of rats after 1 h administration of dayuanyin; 1-baicalin, 2-peoniflorin, 3-astragalosideⅣ (internal standard, IS)

表1 大鼠血浆中芍药苷与黄芩苷的精密度与准确度Tab 1 The precision and accuracy of peoniflorin and baicalin in rat plasma

2.1.3 精密度与准确度 采用三个浓度水平的QC样品考察大鼠血浆中芍药苷与黄芩苷的批内与批间精密度和准确度（n = 6）。芍药苷批内准确度在96.30%-105.02%范围内，批内精密度（RSD）小于12.41%；批间准确度在97.80%-106.65%范围内，批间精密度（RSD）小于10.63%。黄芩苷批内准确度在93.67%-101.30%范围内，批内精密度（RSD）小于10.07%；批间准确度在99.80%-112.44%范围内，批内精密度（RSD）小于11.12%。结果见表1，显示方法精密度和准确度均符合生物样品测试要求。

2.1.4 回收率与基质效应 采用三个浓度水平的QC样品考察大鼠血浆中芍药苷与黄芩苷的回收率与基质效应（n = 3）。空白大鼠血浆中加入被测物经处理后的药物响应值与大鼠空白血浆处理后加入相同浓度被测物响应值的比值作为提取回收率，以具有基质的被测物标准品与不含基质的被测物标准品溶液的响应强度的比值作为基质效应。芍药苷提取回收率在（89.75±7.55）%-（98.52±10.23）%范围内，基质效应在（88.14±8.34）%-（92.97±8.76）%范围内；黄芩苷提取回收率在（88.95±9.88）%-（94.56±7.70）%范围内，基质效应在（92.98±8.89）%-（96.22±5.90）%范围内。精密度（RSD）均在15%以内。结果见表2，显示方法回收率和基质效应均符合生物样品测试要求。

表2 大鼠血浆中芍药苷与黄芩苷的提取回收率与基质效应.n = 3Tab 2 The extraction recovery and matrix effect of peoniflorin and baicalin in rat plasma.n = 3

2.1.5 稳定性 表3结果显示，采用低、高两个水平浓度的QC样品考察大鼠血浆中芍药苷与黄芩苷在实验台放置6 h，-20 ℃冷冻保存15 d和处理后在样品仓放置24 h的稳定性（n = 6），结果显示芍药苷和黄芩苷在上述储存条件下稳定性良好。

表3 大鼠血浆中芍药苷与黄芩苷的稳定性.n = 6Tab 3 The stability data of peoniflorin and baicalin in rat plasma.n = 6

2.2 大鼠体内药动学评价

大鼠灌胃给予10 g·kg-1达原饮后，芍药苷和黄芩苷的吸收速度均较快，达峰时间均较早，且消除也很迅速；黄芩苷出现双峰，其具体机制需要进一步研究。将给药剂量、给药方式、动物种属和测得的血浆药物浓度等信息输入DAS 2.0软件处理后得到芍药苷与黄芩苷的主要药代动力学参数，详见表4，芍药苷和黄芩苷的血浆药物浓度-时间曲线见图2。

表4 芍药苷与黄芩苷的主要药代动力学参数.n = 6Tab4 Main pharmacokinetic parameters of peoniflorin and baicalin.n = 6

图2 芍药苷和黄芩苷在大鼠体内的药-时曲线.n = 6Fig 2 Plasma concentration-time profiles of peoniflorin and baicalin in rats.n = 6

3 讨论

3.1 测定方法与线性范围的确定

采用高效液相色谱法探讨达原饮中芍药苷、黄芩苷等有效成分含量的研究已有报道[4-5]，考虑到高效液相色谱法的灵敏度较低，且达原饮中各有效成分的含量较低，故本研究采用LC-MS/MS技术研究达原饮中两种成分在大鼠体内的药代动力学特征，建立了大鼠血浆中芍药苷和黄芩苷浓度同时测定的方法，并进行了方法学验证。兼顾本实验室液质联用系统的仪器性能、达原饮中芍药苷和黄芩苷的含量及给药剂量，本研究将两种化合物的线性范围设定为5～2000 ng·mL-1可以满足本药代动力学研究的需要。

3.2 前处理方法、流动相及色谱柱的选择

本研究重点考察直接沉淀法处理大鼠血浆样品，包括有机溶剂直接沉淀法，金属盐溶液直接沉淀法以及酸碱沉淀法等，结果显示采用有机溶剂直接沉淀法处理血浆样品，方法操作方便，简单易行，成本较低，处理效率高，适合较大样本量的处理，且专属性和灵敏度能够满足本研究的需要。流动相考察水-甲醇和水-乙腈两种体系的等度洗脱和梯度洗脱方法，最终确定水-乙腈梯度洗脱适合被测物和内标的分离。另外，色谱柱采用Inersil ODS柱（4.6 mm×50 mm，5 µm），获得了良好的峰形、分离度和合适的保留时间。

3.3 内标的选择

理论上内标的最佳选择是同位素内标，但是本研究被测物芍药苷和黄芩苷的同位素内标价格昂贵，较难获得，故本研究采用黄芪甲苷作为内标，其与本研究被测物均为皂苷类化合物，在本实验室质谱系统内的正离子模式下，具有相同的加合离子[M+Na]+峰，可以确保质谱定量的准确性。

3.4 研究意义

达原饮方中芍药清热滋阴，可防诸辛燥药之耗散阴津；黄芩苦寒，清热燥湿。二者共为佐药。配合方中其它药味即可达奏开达膜原，辟秽化浊，清热解毒之功[12-13]。其中，芍药苷和黄芩苷分别为方中芍药和黄芩的主要药效成分，也是达原饮中含量相对较高的两种药效成分[4]。芍药苷具有抗肿瘤、抗氧化、抗抑郁、免疫调节和补血等方面药理活性[14]。黄芩苷具有抗肿瘤，抗炎，对肝、肺、脑损伤的修复保护等作用[15]。选择这两个指标成分研究达原饮在大鼠体内的药代动力学特征具有代表性，对阐明达原饮的体内过程具有显著意义。

本研究首次借鉴和利用先进的LC-MS/MS和现代药动学技术，选取芍药苷和黄芩苷两个成分研究达原饮复杂体系的药代动力学特征。研究发现，大鼠灌胃给予达原饮方后，方中芍药苷和黄芩苷的药代动力学特征与其它研究比较，没有发现显著性差异，结果表明达原饮方中其它药味没有影响芍药苷和黄芩苷在大鼠体内的药代动力学特征。该研究结果对于阐明该复方的体内经时变化和作用机制具有非常重要的意义，该研究证明芍药苷和黄芩苷是达原饮中能够通过体内的生物屏障进入循环系统的药物分子，因此二者均具备是达原饮药效物质基础且具有与药效关联的生物活性的可能性[16]。对于创新中药的开发和中药合理用药打下良好基础。

综上，本研究建立的大鼠血浆中芍药苷和黄芩苷同时测定的LC-MS/MS方法可满足临床前药代动力学研究中对于方法学验证的要求，该方法灵敏，简便易行，适用于达原饮的药代动力学研究，并可以在相关临床研究中推广。