基于一测多评法对丁蔻理中丸中6种成分的质量控制研究

2020-03-13何胜利河南中医药大学第三附属医院药学部河南郑州450000遂成药业股份有限公司河南郑州4550

中国药物应用与监测 2020年1期

杨丽，何胜利（.河南中医药大学第三附属医院药学部，河南郑州 450000；.遂成药业股份有限公司，河南郑州 4550）

丁蔻理中丸处方源于《卫生部颁药品标准》中药成方制剂第一册，由干姜、炒白术、豆蔻、党参、丁香和甘草6味中药材加工而成，具有温中散寒、补脾健胃的功效，主要用于脾胃虚寒、脘腹挛痛、呕吐泄泻、消化不良等病症的治疗[1]。本文参考中药质量标志物以君药为主，兼顾臣、佐、使药的确定原则，选取方中君药干姜所含6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚，臣药白术所含白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ和佐药丁香所含丁香酚为目标成分，以白术内酯Ⅰ为内标物，建立其与白术内酯Ⅲ、丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚的校正因子，计算各成分含量，探讨一测多评法在丁蔻理中丸多指标质量评价中应用的可行性。

1 仪器与试药

LC-10ATvp型高效液相色谱仪（日本岛津仪器公司）；Agilent 1120型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；AB135-S型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；SB-5200DT加热型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。对照品白术内酯Ⅲ（批号：111978-201501，含量99.9%）、白术内酯Ⅰ（批号：111975-201501，含量99.9%）、丁香酚（批号：110725-201716，含量99.6%）、6-姜辣素（批号：111833-201806，含量99.9%）、8-姜酚（批号：111993-201601，含量93.8%）、10-姜酚（批号：111994-201501，含量97.1%）均来源于中国食品药品检定研究院；丁蔻理中丸（规格：每26粒重1 g，批号：117005、117007、117008）来源于山西天生制药有限责任公司；甲醇、乙腈为色谱纯，其它试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Agilent Extend C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30 ℃；流动相A：甲醇-乙腈（1∶1），流动相B：0.1%磷酸溶液，梯度洗脱：0～11.0 min，55.0%A；11.0～28.0 min，55.0%A→68.0%A；28.0～46.0 min，68.0%A→84.0%A；46.0～55.0 min，84.0%A→55.0%A；体积流量1.0 mL·min-1；检测波长分别为220 nm（0～21.0 min检测白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ）[2-5]和280 nm（21.0～55.0 min检测丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚）[6-8]；进样量10 μL。

2.2 混合对照品溶液

精密称取白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚对照品适量，用70%甲醇分别制成每1 mL含0.218、0.142、2.734、1.208、0.292、0.356 mg的单成分储备液。再依次精密吸取单成分储备液各2.5 mL，用70%甲醇制成质量浓度分别为10.9、7.1、136.7、60.4、14.6和17.8 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 丁蔻理中丸供试品溶液

取丁蔻理中丸适量，研细，混匀，取约1.0 g，精密称定，精密加入70%甲醇25 mL，称重，SB-5200DT加热型超声波清洗机超声（功率：360 W，频率：40 kHz）提取40 min，放冷，称重，用70%甲醇补重，摇匀，过滤，制成丁蔻理中丸供试品溶液。

2.4 阴性对照溶液

按照丁蔻理中丸的处方比例和制法，分别制备不含白术、不含丁香、不含干姜的3种阴性对照样品，再按“2.3”项下方法制成对应的3种阴性样品溶液。

2.5 专属性实验

取上述丁蔻理中丸供试品溶液、阴性对照溶液及混合对照品溶液依法进样检测，记录色谱图，色谱图见图1。结果表明阴性对照对测定无干扰，理论塔板数按待测成分色谱峰计均不低于3500，待测成分色谱峰与相邻峰均能达到有效分离，分离度均大于1.5。

2.6 线性关系考察

图1 HPLC色谱图A-混合对照品，B-供试品，C-白术阴性样品，D-丁香阴性样品，E-干姜阴性样品；1-白术内酯Ⅲ，2-白术内酯Ⅰ，3-丁香酚，4-6-姜辣素，5-8-姜酚，6-10-姜酚Fig 1 HPLC chromatogramsA-mixed reference substance, B-sample, C-negative sample without atractylodis macrocephalae rhizoma, D-negative sample without caryophylli flos, E-negative sample without zingiberis rhizoma; 1-atracylenolideⅢ, 2-atracylenolideⅠ, 3-eugenol, 4-6-gingerol, 5-8-gingerol, 6-10-gingerol

分别精密量取“2.2”项下单成分储备液各2.0 mL，置同一20 mL量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，制成线性混标溶液A；再精密量取线性混标溶液A各适量，用70%甲醇依次稀释2、4、8、16、20倍，制成线性混标溶液B～F，依法进样测定6个成分色谱峰的峰面积，以质量浓度x为横坐标，峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程，结果见表1。

表1 线性关系实验结果Tab 1 The results of the linear relationship test

2.7 精密度实验

精密吸取同一份丁蔻理中丸供试品溶液，进样测定6次，测得白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚峰面积的RSD分别为1.02%、1.13%、0.58%、0.72%、0.98%、0.85%。

2.8 重复性实验

取同一批次的丁蔻理中丸供试品适量，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，进样测定白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚的峰面积，计算待测成分含量，结果所测6种成分含量的RSD分别为1.83%、0.96%、0.55%、1.60%、1.89%、0.76%。

2.9 稳定性实验

取同一份丁蔻理中丸供试品溶液，于0、2、4、8、12、16 h进样检测白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚的峰面积，结果示丁蔻理中丸供试品溶液室温下16 h内稳定，6种成分峰面积的RSD分别为0.98%、1.07%、0.63%、1.75%、0.92%、0.81%。

2.10 加样回收率实验

取同一批次已知含量的丁蔻理中丸样品适量，研细，取9份，每份约0.5 g，精密称定，参考《中国药典》（2015年版）四部药品质量标准分析方法验证指导原则要求，分别精密加入另行配制的混合对照品溶液（白术内酯Ⅲ 0.124 mg·mL-1、白术内酯Ⅰ0.082 mg·mL-1、丁香酚1.758 mg·mL-1、6-姜辣素0.784 mg·mL-1、8-姜酚0.156 mg·mL-1、10-姜酚0.214 mg·mL-1）0.5 mL3份、1.0 mL3份、1.5 mL3份，再按上述方法制成加样供试品溶液，依次进样测定各成分峰面积，计算加样回收率。结果示各成分的平均加样回收率分别为97.86%、96.95%、100.03%、99.31%、97.74%、98.48%，RSD分别为1.09%、1.26%、0.85%、0.65%、1.54%、1.12%。

2.11 校正因子的计算

精密吸取“2.6”项下制备的线性混标溶液F～A各适量，依法进样测定各成分的峰面积，以白术内酯Ⅰ为内标物，根据校正因子计算公式ƒ内/待=ƒ内/ƒ待=（y内x待）/（y待x内）（式中y内为白术内酯Ⅰ的峰面积，x内为白术内酯Ⅰ的质量浓度，y待为待测成分的峰面积，x待为待测成分的质量浓度）计算白术内酯Ⅲ、丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚的校正因子，结果见表2。

表2 各成分的校正因子Tab 2 Correction factors of various constituents

2.12 不同仪器、不同色谱柱对校正因子的影响

对比考察2台高效液相色谱仪及3种色谱柱对白术内酯Ⅲ、丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚校正因子的影响，结果显示白术内酯Ⅲ、丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚校正因子的RSD分别为0.62%、1.03%、0.90%、0.68%、1.28%，表明不同仪器、不同色谱柱对校正因子无显著影响，结果见表3。

2.13 待测成分色谱峰的定位

本文以白术内酯Ⅰ为内标色谱峰，考察两台高效液相色谱仪及3种色谱柱条件下，待测成分白术内酯Ⅲ、丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚色谱峰的相对保留时间值，结果显示白术内酯Ⅲ、丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚相对保留时间值的RSD分别为0.52%、0.37%、0.71%、0.86%、0.65%，表明不同仪器、不同色谱柱对相对保留时间值无显著影响，结果见表4。

2.14 丁蔻理中丸含量测定中QASM法与外标法测定结果的比较

取3个批次的丁蔻理中丸供试品，每个批次平行制备3份供试品溶液，依法进样测定各成分的峰面积，分别采用一测多评法和外标法计算丁蔻理中丸中白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚的含量，结果见表5。结果表明一测多评法计算值与外标法测定值无显著差异。

3 讨论

3.1 待测定成分的选择

丁蔻理中丸由干姜、炒白术、豆蔻、党参、丁香和甘草等6味中药材加工而成，方中干姜辛热、温中散寒，为君药；白术、豆蔻健脾燥湿、温中消食，党参健脾益肺，合为臣药；丁香辛温、降逆止呕，为佐药；甘草调和诸药兼补脾和中为使药，全方药味合用，共达温中散寒、补脾健胃的功效。6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚等姜酚类为干姜的代表性成分[9]，白术主要含有内酯类和挥发油成分，其中白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ等内酯类成分为其主要有效成分；丁香主要含丁香酚等挥发油成分，本文选取白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚为定量测定目标成分。

3.2 供试品制备方法的选择

本研究依次对供试品制备的提取溶剂（甲醇[2-5,8]、70%甲醇[6]、95%乙醇）、制备方式（超声提取[2-5,10]、加热回流提取[11]）和提取时间（20、40、60 min）进行对比考察，以所测各成分的综合提取率为指标，结合色谱峰峰形及分离度等指标，同时考虑到操作的便捷性，最终确定采用70%甲醇超声提取40 min作为丁蔻理中丸供试品溶液的制备方法。

综上，本研究采用一测多评法实现了对丁蔻理中丸所含成分白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、丁香酚、6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚的同时测定，所建立的方法操作便捷，结果准确，降低了检验成本，为丁蔻理中丸质量标准的提高研究提供有力的数据支持。HPLC指纹图谱具有整体性、模糊性、专属性等特点，采用HPLC指纹图谱对丁蔻理中丸药品质量的整体描述和评价还有待进一步研究。