烤烟不同成熟期色素含量变化及其与叶绿体超微结构的关系探究

郑小雨, 李常军, 路晓崇, 王刚, 赵俊杰, 李云平,彭玖华, 杨超,*

(1.河南农业大学烟草学院, 郑州 450002; 2.中国烟草总公司重庆市公司, 重庆 400023;3.江苏中烟工业有限责任公司, 南京 210019)

叶绿体是植物细胞内最重要、最普遍的质体，是进行光合作用核心反应特有的细胞器[1]。其与烟叶的主要品质成分有直接或间接的联系，直接影响烤烟质量[2-4]。叶绿素则是叶绿体中最重要的色素，是绿色植物进行光合作用吸收光能和光能转化的物质，叶片在成熟过程中由绿变黄便是受到叶绿素含量的影响[5-7]。叶绿体能够将光能转化为化学能，主要是由于其具有基粒膜和间质膜系统，载有活跃的叶绿素和专一的酶成分[8]。色素含量外在反映了叶绿体结构的变化。因此，研究烤烟成熟期色素含量变化及其与叶绿体超微结构的关系，具有重要的现实意义。戴培刚等[9]研究表明，随着成熟期的推进，叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量逐渐降低；严晓芦等[10]研究表明，低光照会阻碍叶绿体的生长发育，导致叶绿体基质片层浓度降低，淀粉粒减小；黄明月等[11]研究表明，有机肥施用量的增加有利于叶绿体的发育，其内淀粉粒的数目增加、体积变大，嗜锇颗粒和类囊体片层数量增多，促进烟叶中叶绿素的合成。目前对于烤烟成熟期色素含量和叶绿体超微结构的研究多集中在某单一方面，没有将二者结合起来。本研究以河南主要栽培的三个烤烟品种‘云烟87’‘K326’和‘豫烟6号’为试验材料，针对未熟、适熟和过熟的中部叶叶片，进行活体叶绿素SPAD值、叶绿素含量以及相关酶活性的测定、叶绿体超微结构的观察，并对叶绿体超微结构数据进行量化处理，探讨成熟过程中色素含量与叶绿体超微结构的变化，使叶绿体内部结构的变化外在表现于色素含量的变化，以期能够更好地把握烟叶成熟度并在最佳成熟度采收烟叶，以提高烟叶质量。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2018年在河南省洛宁县小界卫洼烟草科技示范基地(E111°38′，N34°26′)进行，选用‘云烟87’‘K326’和‘豫烟6号’为试验材料，以中部叶为研究对象。烟苗于2018年5月4日移栽，以培育“中棵烟”目标进行田间管理，单株留叶数18～20片。土壤基本理化性质如下：碱解氮75.18 mg·kg-1、有机质13.52 mg·kg-1、速效磷9.17 mg·kg-1和速效钾164.37 mg·kg-1，土壤pH 7.26。试验田肥力中等，土壤质地为黄棕壤。

1.2 试验设计

试验采用随机区组设计，重复3次，共9个小区，四周栽种保护行，每小区栽植烟株300株，行距110 cm，株距55 cm，按照当地优质烟叶生产技术规范种植管理，烟田施氮量为72 kg·km-2，使用烟草专用复合肥(N∶P2O5∶K2O=1∶1∶2)。取样部位为中部叶(10～12叶位)，取未熟、适熟、过熟三种不同成熟度的叶片，成熟度判定标准见表1，取样时选取叶片第5到第7支脉之间左右对称的部位(避开主支脉)，选取叶片时应注意叶片保持完整，大小一致。

表1 烤烟叶片成熟度判定标准Table 1 Judging criteria for maturity level of flue-cured tobacco leaves

1.3 测定指标与方法

1.3.1活体叶绿素SPAD值测定 利用手持SPAD-502PLUS叶绿素测定仪(日本)，分别测量中部叶(与叶绿体超微结构观察为同一叶片)的SPAD值，每个叶片分别测定主脉对称两侧的叶基部、叶中部、叶尖3个部位6个点，每个点测定3次，取平均值。

1.3.2叶绿素含量测定 取完叶片立即放入烘箱杀青烘干，丙酮提取分光光度法[12]测定，分别于662、644 nm下比色，记录OD值。利用以下公式计算叶绿素a(Ca)和叶绿素b(Cb)含量。

Ca=9.784OD662-0.990OD644

Cb=21.426OD662-4.650OD644

1.3.3叶绿素酶活性测定 参照郁志芳等[13]方法测定叶绿素酶活性。

1.3.4叶绿体超微结构观察 选取中部叶片第5到第7支脉之间右侧相同的位置，用手术刀切成1 mm×1 mm的小块，立即放入5%戊二醛溶液(pH 7.2～7.4，0.1 mol·L-1PBS缓冲液配制)中固定，再用1%锇酸(pH 7.2～7.4，0.1 mol·L-1PBS缓冲液配制)固定，乙醇梯度脱水，然后经纯丙酮脱水后用Epon812环氧树脂包埋聚合。用Leica EM UC6 Miultracut超薄切片机(Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany)切出超薄切片, 用醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色, 再用JEM-1400 Plus型透射电镜(日本)进行观察并拍照, 每个处理观察10个视野。

1.4 数据分析

运用Microsoft Excel 2010进行试验数据的整理和统计，运用Origin 2018进行图表绘制，运用Photoshop 2018进行图片整理，运用SPSS 22进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 不同成熟度烤烟中部叶的活体叶绿素SPAD值

SPAD值可以反映单位面积鲜叶叶绿素的相对含量。由表2可见，豫烟6号、K326和云烟87中部叶叶绿素SPAD值均随着成熟度的提升呈现下降趋势，且不同成熟度间差异显著。在未熟时期，中部叶的SPAD值表现为豫烟6号>K326>云烟87；适熟时期，表现为豫烟6号>K326>云烟87；过熟时期，表现为豫烟6号>K326>云烟87，与未熟时期趋势一致。

表2 三个品种不同成熟度叶片活体的叶绿素SPAD值Table 2 Chlorophyll SPAD values in leaves of three varieties with different maturity levels

2.2 不同成熟度烤烟中部叶的叶绿素含量

叶绿素是鲜烟叶中的质体色素之一，它不仅决定调制后烟叶的叶色，而且对烟草香味物质的形成和品质的提高具有重要贡献[14-15]。由图1可知，3个品种间叶绿素a含量均大于叶绿素b含量。豫烟6号、K326和云烟87中部叶叶绿素a和叶绿素b的含量均随着成熟度的不断提升而逐渐减小，不同成熟度间差异显著，且在未熟到适熟过程中叶绿素a和叶绿素b的变化速率要大于适熟到过熟时期的变化过程。不同时期的叶绿素a含量在3个品种间差异不显著。3个品种中，在未熟时期，豫烟6号的叶绿素b含量最大，K326和云烟87间无显著差异；其他时期，3个品种间差异不显著。

注：不同小写字母表示不同品种、不同成熟度间差异在P<0.05水平具有统计学意义。Note: Different lowercase letters indicate significant difference between different varieties and different maturity levels at P<0.05 level.图1 不同成熟度叶片的叶绿素a和叶绿素b含量Fig.1 Contents of chlorophyll a and b in leaves of different maturity levels

2.3 不同成熟度烤烟中部叶的叶绿素酶活性

烟叶成熟过程中叶绿素大量降解，叶绿素酶活性参与催化这一进程。由图2可知，在烤烟成熟过程中，随着成熟度的不断增加，三个品种叶绿素酶活性均呈现下降趋势。未熟至适熟过程中，叶绿素酶活性的变化更加迅速，适熟至过熟过程中，酶活性的下降趋势比较缓慢。3个品种间，叶绿素酶活性不存在有统计学意义的差异。

注：不同小写字母表示不同品种、不同成熟度间差异在P<0.05水平具有统计学意义。Note: Different lowercase letters indicate significant difference between different varieties and different maturity levels at P<0.05 level.图2 不同成熟度叶片的叶绿素酶活性Fig.2 Chlorophyllase activity in leaves of different maturity levels

2.4 不同成熟度烤烟中部叶叶片的叶绿体超微结构

植物叶片成熟过程中叶绿体超微结构变化的研究，可以在微观层面上对其有更深的认识，也内在反映了叶片衰老时结构与功能之间的关系[16-17]。由图3可知，K326、云烟87和豫烟6三个烤烟品种叶片的叶绿体超微结构在不同成熟度上呈现出一致的规律。未熟叶片中(图3A、3D、3G),叶绿体沿质膜边缘分布，形状呈椭圆形，结构完整且排列紧密，淀粉粒、嗜锇颗粒、基粒片层和基质片层被完整地包裹在叶绿体被膜中，叶绿体中含有少量淀粉粒和嗜锇颗粒，基粒垛叠较厚，基粒片层结构紧凑,与基质片层间界限明显，基质片层也清晰可见。适熟叶片(图3B、3E、3H)较未熟叶片相比，叶绿体保持了其结构的完整性，但体积增大；嗜锇颗粒和淀粉粒数量增多，体积膨胀；基粒片层和基质片层虽然可以观察到，但因为受到淀粉粒的挤压导致片层结构比较疏松、排列紊乱、不清晰，形状也变为长条形；一些淀粉粒向着细胞中部游离。过熟叶片(图3C、3F、3I)的叶绿体中基粒片层被挤压为线形且结构松散、排列杂乱无序、产生扭曲现象，基质片层几乎不可见，淀粉粒和嗜锇颗粒向着细胞中部游离，叶绿体被膜破损严重，其中品种K326和豫烟6号已经完全破裂。由此可以得出，在烟叶成熟衰老过程中，细胞内叶绿体呈现明显的衰老症状。

A：K326，未熟；B：K326，适熟；C：K326，过熟；D：云烟87，未熟；E：云烟87，适熟；F：云烟87，过熟；G：豫烟6号，未熟；H：豫烟6号，适熟；I：豫烟6号，过熟。GL—基粒片层；CM—叶绿体被膜； SL—基质片层；SG—淀粉粒；O—嗜锇颗粒。A: K326, unripe; B: K326, ripe; C: K326, overripe; D: Yunyan 87, unripe; E: Yunyan 87, ripe; F: Yunyan 87, overripe; G: Yuyan 6, unripe; H: Yuyan 6, ripe; I: Yuyan 6, overripe. GL—Grana lamella; CM—Chloroplast envelope; SL—Stroma lamella; SG—Starch grains; O—Osmiophilic granules.图3 不同成熟度烤烟叶片的叶绿体超微结构Fig.3 Chloroplast ultrastructure of flue-cured tobacco leaves with different maturity levels

2.5 不同成熟度烤烟中部叶的叶绿体超微结构统计

由表3可知，不同烤烟品种中部叶叶绿体的淀粉粒、嗜锇颗粒和基粒片层分布情况呈现出相同的规律，不同成熟度的烤烟叶片间差异显著。随着成熟度的提升，单个叶绿体淀粉粒和嗜锇颗粒总值增多，基粒片层数减少，但在品种间差异不显著。片层垛叠数方面，随生育期的延长，低片层数基粒片层所占比例升高。在不同成熟度叶片间，未熟和适熟烟叶基粒片层垛叠数基本在11～30之间，过熟烟叶片层垛叠数没有大于21的，在0～10间居多。由此可见，随着烟叶成熟度的提升，淀粉粒和嗜锇颗粒增多，基粒片层数减少，基粒片层垛叠数也减少，这也与叶绿体超微结构的观察结果一致。

表3 不同成熟度中部叶的叶绿体超微结构统计Table 3 Statistics of ultrastructural chloroplasts in middle leaves of different maturity levels

2.6 不同成熟度烤烟中部叶的色素含量与叶绿体超微结构统计量的相关分析

由表4可知，烤烟中部叶单个叶绿体淀粉粒和嗜锇颗粒总值与叶片的SPAD值、叶绿素a含量、叶绿素b含量和叶绿素酶活性均表现为极显著负相关关系；基粒片层数与叶片的SPAD值、叶绿素a含量和叶绿素b含量均表现为极显著正相关关系，与叶绿素酶活性呈显著正相关关系；片层垛叠数在0～10的基粒片层与叶片的SPAD值、叶绿素a含量和叶绿素b含量均表现为极显著负相关关系，与叶绿素酶活性呈显著负相关关系；片层垛叠数在11～20的基粒片层与叶片的SPAD值、叶绿素a含量、叶绿素b含量和叶绿素酶活性的相关关系不显著，片层垛叠数在20以上的基粒片层与叶片的SPAD值、叶绿素a含量、叶绿素b含量和叶绿素酶活性均表现为极显著正相关关系。由此可知，不同成熟度烤烟中部叶色素含量与叶绿体基粒片层分布情况相关性较强。

表4 不同成熟度烤烟中部叶色素含量与叶绿体超微结构统计量的相关分析Table 4 Correlation analysis of pigment content and chloroplast ultrastructure statistics of flue-cured tobacco at different maturity levels

3 讨论

叶绿素含量是受叶片衰老影响最显著的指标，在田间成熟过程烟叶的颜色变化实质是烟叶内叶绿体色素逐渐减少的过程[18]。潘义宏等[19]研究表明,中部叶成熟采收烟叶的总叶绿素含量与SPAD值具有相关性；李旭华等[20]发现叶绿素a、叶绿素b和SPAD值随着成熟度的增加不断减少，中部叶不同成熟度烟叶叶绿素含量与SPAD值的变化表现出显性正相关，在适熟期达到极显著正相关。本研究中3个烤烟品种中部叶叶绿素含量及活体叶绿素SPAD值均随着生育期的延长呈现出下降趋势，且两者间表现出高度一致性。这与前人[19-20]的研究结果一致。3个品种间叶绿素a含量差异不显著，在未熟时期叶绿素b含量在品种间有差异，豫烟6号显著高于另外2个品种，这可能和品种差异有关。在过熟时期品种间的差异均不显著，这可能与过熟时期叶绿体结构也已经完全解体，烟叶内的营养元素达到平衡有关。

叶绿素酶存在于叶绿体中，其催化叶绿素的降解过程[21]。鹿莹[22]研究表明，光质影响烟叶色素含量及组成，也影响色素降解酶的活性，色素含量与色素降解酶活性呈现出正相关趋势；王丹[23]研究表明,烟叶成熟过程中叶绿素大量降解，打顶后叶绿素酶活性呈现先上升后快速下降，最后缓慢下降的过程。本研究中随着成熟度的不断增加，3个品种叶绿素酶活性均呈现下降趋势。未熟至适熟过程中，叶绿素酶活性的变化比较迅速，适熟至过熟过程中，酶活性下降的趋势比较缓慢，这与前人[22-23]研究结果一致。3个品种间，叶绿素酶活性差异不显著，但在不同成熟度间差异显著，表现为随着成熟度的增加酶活性降低，这与前期测量的活体叶绿素SPAD值及叶绿素b含量的变化规律一致。

烟草叶片中叶绿体非常发达，即是烟叶光合作用的重要场所，也是烟叶光合产物合成、积累的主要场所[24-25]，烟叶的主要品质成分也受其影响,并与其有着重要的联系[26]。本研究表明，叶绿体在成熟过程中基粒片层结构一步步离散乃至丧失，这是细胞进入衰老期后最早和最明显的现象，它引发了整个细胞的衰老[27]。烤烟在成熟时淀粉含量过高是影响烤烟品质的重要原因，在叶片衰老过程中叶绿体逐渐衰老，叶肉细胞内淀粉逐渐增加[28]。本研究表明，随着成熟度的提升，叶绿体的结构由完整到破裂，淀粉粒和嗜锇颗粒体积增大，基粒片层由紧凑变为疏松，结构紊乱甚至出现扭曲现象，基质片层和基粒片层间的界限明显度也下降，过熟期基质片层几乎不可见，叶绿体被膜也逐步破损，且随着烟叶成熟度的提升，基粒片层数减少，基粒片层垛叠数也减少，这与张柳等[28]的研究结果一致。王婵娟等[29]研究表明，随着成熟度的加深，叶绿体内淀粉粒只增大无明显增多，嗜锇颗粒体积增大，片层结构清晰度下降并解体，过熟时内部的淀粉粒和嗜锇颗粒游离到细胞中部。而本研究表明，随着生育期的延长，淀粉粒和嗜锇颗粒增多，可能是本研究烟叶在后期打顶，有机物在叶片内积累不易向外运输，从而导致淀粉在叶绿体中积累。

本研究相关分析表明，烤烟中部叶的SPAD值、叶绿素a和叶绿素b与叶绿体基粒片层数、片层垛叠数在20以上的基粒片层均表现出极显著正相关关系，与片层垛叠数在0～10的基粒片层均表现出极显著负相关关系，说明在烤烟成熟过程中色素的含量变化受叶绿体基粒片层的影响较大；烤烟叶片叶绿素酶活性与叶绿体基粒片层数呈显著正相关关系，与片层垛叠数在0～10的基粒片层呈显著负相关关系，与片层垛叠数在20以上的基粒片层表现为极显著正相关关系，说明叶绿素酶活性的变化也受基粒片层的影响；片层垛叠数在11～20的基粒片层则与叶片的SPAD值、叶绿素a、叶绿素b和叶绿素酶活性均没有显著相关性关系，说明在成熟过程中片层垛叠数在11～20的基粒片层数目没有发生变化，均保持一定的稳定性。

综上所述，随着成熟度的提升，不同烤烟品种中部叶叶绿素含量、活体叶绿素SPAD值及叶绿素酶活性均随着生育期的延长呈现下降趋势；不同品种烟叶细胞的叶绿体结构由完整到破裂；淀粉粒和嗜锇颗粒增多、体积增大，并向着细胞中部游离；基粒片层由紧凑变为疏松，结构紊乱扭曲，基粒片层数和片层垛叠数也减少。烤烟成熟期中部叶的SPAD值、叶绿素a、叶绿素b含量和叶绿素酶活性与叶绿体内基粒片层数及片层垛叠数也具有较强的相关关系。本研究分析了烤烟成熟过程的色素含量与叶绿体超微结构的关系，使叶绿体内部结构的变化外在表现为色素含量的变化，对指导农业生产具有重要意义。