适钙植物报春苣苔根际土壤微生物群落结构

苏迪, 鲍恩俣, 王进

(贵州师范大学喀斯特研究院, 国家喀斯特石漠化防治工程技术研究中心, 贵阳 550001)

喀斯特地貌覆盖全球20%左右的无冰陆地面积[1]，贵州省喀斯特地区是我国西南喀斯特地貌中的核心区域，是我国乃至全世界连片面积最大、发育最完全的喀斯特片区之一[2]。喀斯特生态系统脆弱，生态容易被破坏，出现土壤 “石漠化”现象。再加上喀斯特生境基岩多为石灰岩类，因此，喀斯特地区岩石容易裸露，土壤具有较高的钙含量。为适应喀斯特地区这一典型的钙生性环境，形成了一系列具有适应高钙性、岩生性的喀斯特植物[3]。钙是植物生长的必需元素之一，同时是重要的第二信使，对植物生理功能有重要影响[4]。近年来，国内外在植物钙生适应方面取得了一定研究进展[5-6]，但还存在很多空白。钙生环境是喀斯特地貌中一个极其重要的生境，因此研究植物适应钙生土壤，是研究喀斯特生态系统中的重要一环，对于植被修复喀斯特石漠化具有十分重要的意义。报春苣苔属(Primulina)是我国喀斯特植物的一个重要类群, 该属植物的地理分布具有高度的土壤专一性，绝大多数物种仅分布在石灰岩基岩土壤[7]。因此，报春苣苔属植物是喀斯特地区高钙环境适应机制研究的理想材料之一。

土壤微生物是土壤生态系统中重要部分，对于土壤物质循环起到重要作用[8]。植物-土壤微生物交互作用是陆地生态系统中极其重要的研究内容，涉及碳固定、营养元素循环和温室气体排放等生态问题[9-11]。土壤根际微生物与植物根系相互作用密切，它参与根际生态系统的物质转化和循环，对植物的生长发育、环境适应性具有重要作用[12-13]。不同植物根际微生物群落结构存在极大差异[14]，甚至同种植物不同基因型的根际微生物群落之间也存在差异[15]。植物根际土壤微生物群落结构具有很强的特异性，它是植物-微生物根际互作机制的重要研究内容之一。因此，研究不同植物的根际微生物对于解析植物-微生物交叉互作机制是极其重要的，有利于解析植物的高度专一性地理分布机理。

适钙植物是喀斯特地区重要的自然资源，是喀斯特生态系统中极其重要的植被资源，研究喀斯特适钙植物根际土壤微生物的群落结构变化是适钙植物-微生物根际互作适应机制的重要基础之一，对喀斯特土壤生态系统的研究具有重要意义。本研究通过高通量测序报春苣苔根际微生物的16S rRNA V4和ITS1区序列，解析了报春苣苔根际微生物群落结构，分析了土壤钙对适钙植物根际微生物群落的影响，以期为解析喀斯特适钙植物根际微生物群落结构、研究根际微生物对喀斯特植物适钙机制提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 土壤采样

本研究采集报春苣苔(PrimulinatabacumHance)的根际土壤样品。将植株从土壤中采出，然后收集抖动掉落的土壤。就近采集1 m外的非植物根际外周土壤样品。采集土壤样品无菌袋分装，4 ℃运输回实验室后，-80 ℃冻存。分别采集非植物根际外周土壤(bulk soil，BS)和根际土壤(rhizosphere soil，RSS)样品各6个。

1.2 高通量测序及分类注释

使用MOBIO Powersoil©DNA isolation kit试剂盒，按说明书操作提取土壤样品宏基因组DNA。以宏基因组DNA为模板，扩增细菌16S rRNA V4和真菌ITS1区在Illumina平台测序。引物序列：16S rRNA V4-F (5′-GTGCCAGCM-GCCGCGGTAA-3′)、V4-R (5′-GGACTACHVGG-GTWTCTAAT-3′)和ITS1-F(5′-CTTGGTCATTT-AGAGGAAGTAA-3′)、ITS1-R(5′-GCTGCGTTC-TTCATCGATGC-3′)。根据测序数据量、GC含量、序列平均质量等用Fastqc软件对下机序列进行质控[16]。质控后数据用QIIME软件进行分析[17]，使用其内部编程去除序列两端的引物及barcode序列，去除含嵌合体及短序列，获得有效序列。用Uparse软件按>97%序列聚类的原则合并OTUs(operational taxonomic units)[18]。用RDP classifier基于Greengene数据库(http://greengenes.secondgenome. com/)对16S rRNA 细菌OTUs进行分类注释[19-20]；同时用blast方法基于Unit数据库(https://unite.ut.ee/)进行ITS1真菌OTUs注释分析[21-22]。

1.3 土壤钙含量测定

土壤可溶性钙含量参照李酉开[23]的方法测定。

1.4 统计分析

利用QIIME软件分析微生物群落多样性指数；用R的vegan、ggplot2、psych等软件包分析，并进行统计计算及作图。利用T检验算法比较两组土壤微生物群落的差异性。采用蒙特卡罗置换检验分析土壤微生物群落与土壤钙含量与土壤微生物群落之间的相关性，利用斯皮尔曼等级相关系数分析土壤钙和土壤细菌菌群丰度之间的关系。

2 结果与分析

2.1 测序数据分析

测序数据进行质控后获得有效分析数据，对测序结果进行测序数据量、有效数据效率、Q30等统计，评估测序结果质量，结果见表1。在细菌水平，测序数据的有效数据率在90%以上，Q30达到98%以上。真菌的测序数据有效率稍低于细菌，达到80%以上，Q30也达到98%以上。数据分析说明，测序中建库质量较好，且不存在其他污染，获得较好的测序结果，测序质量可以满足后期的分析需要。从样品中随机抽取一定测序数据，统计对应OTUs数目，绘制对应的稀释曲线(图1)。结果表明，样本的测序数据量合理，基本覆盖了样品中的物种，测序质量能满足后续的物种分析，能较全面地反映报春苣苔根际土壤微生物群落多样性。

图1 稀释曲线Fig.1 Rarefaction curve

表1 测序质量统计分析Table 1 Statistical analysis of sequencing quality

2.2 报春苣苔根际土壤微生物群落结构

2.2.1门水平微生物群落结构差异 利用Uparse软件对有效数据按>97%序列相似性进行聚类OTUs，统计OTUs结果见图2。细菌共有6 234个OTUs，其中，1 301个OTUs只存在于报春苣苔根际土壤内，而1 357个OTUs只存在于外周土壤。真菌共有1 762个OTUs，323个OUTs只存在于报春苣苔根际土壤内，而543个OTUs只存在于外周土壤。根据Greengene和Unit数据库分别对细菌和真菌OTUs进行分类注释，结果发现，细菌分布于41个门569属，真菌分布于6门276个属。41个细菌门内，6个门内的细菌菌群相对丰度存在显著性差异；而在真菌中，在门分类组成上无显著性差异。分析主要门的微生物组成可知(图2)，在报春苣苔根际土壤细菌中的优势菌门为变形菌门(Proteobacteria，27.45%±4.24%)、放线菌门(Actinobacteria，22.16%±4.42%)、酸杆菌门(Acidobacteria，15.05%±2.24%)，它们在根际土壤细菌群落占64%以上。而在非根际(外周)土壤中,优势菌门为变形菌门(Proteobacteria，43.23%±8.24%)、放线菌门(Actinobacteria，26.40%±7.82%)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes，10.30%±4.54%)，它们占非根际土壤细菌的79%以上。无论是根际还是非根际土壤中，变形菌门和放线菌门都是主要优势菌门，但是在报春苣苔根际土壤细菌群落中，它们的优势明显下调，其他门内细菌群落丰度升高。而在根际土壤细菌中，酸杆菌门内菌群丰度显著上升，成为优势菌门；相对的芽单胞菌门却受到抑制，丰度显著下降。而根际/非根际土壤真菌群落在门组成上却没有显著性差异，优势菌门都表现为：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和接合菌门(Zygomycota)，它们占所有菌群的99%以上。

注：*表示差异在P<0.05水平具有统计学意义。Note: * indicates significant difference at P<0.05 level.图2 门水平上微生物结构差异分析Fig.2 Analysis of microbial structure differences at phylum level

2.2.2属水平微生物群落结构差异 报春苣苔的根际和非根际土壤微生物群落是非常丰富的，包含569个属的细菌及276个属的真菌(图3)。分析各属的细菌和真菌发现，有59个属的细菌和48个属的真菌只存在于报春苣苔根际土壤，而90个属的细菌和68个属的真菌只存在于非根际土壤中。在报春苣苔根际/非根际土壤细菌中，56个属的细菌丰度存在显著性差异，且细菌丰度1%以上的属中有8个，分别是显著升高的小梨形菌属(Pirellula)、乳酸菌属(Lactobacillus)、变杆菌属(Variibacter)等；显著下降的鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、克洛氏菌属(Crossiella)。而真菌中却没有差异显著的属。报春苣苔根际土壤微生物在属的水平含量比较高的细菌包括Lactobacillus、H16、Gaiella、RB41属；真菌包括伞状霉属(Umbelopsis)、被孢霉属(Mortierella)。同时结果还表明，注释到属水平时，非根际土壤内的微生物分类注释水平较高，且在细菌中非根际注释水平显著高于根际的；并且细菌的注释水平远高于真菌的。这可能与目前对于细菌微生物群落结构的研究远多于真菌，以及非植物根际土壤的研究远多与植物根际土壤的研究现状有关。因此，在土壤真菌群落及植物根际微生物群落等领域还有大量需要研究的空白。

从图3可以看出，报春苣苔根际土壤微生物群落和非根际土壤微生物群落结构差异是显著的，根际土壤和非根际土壤之间对于微生物的生长环境是有差异的。推测认为，报春苣苔的根系生长对于微生物群落结构的影响明显。报春苣苔的根系生长有利于酸杆菌门细菌的生长，抑制芽单胞菌门和变形菌门内细菌。同时报春苣苔根际生长对于土壤细菌群落结构的影响显著高于真菌群落结构。

注：*表示差异在P<0.05水平具有统计学意义。Note: * indicates significant difference at P<0.05 level.图3 属水平上微生物群落结构差异分析Fig.3 Analysis of microbial community structure difference at genus level

2.3 报春苣苔根际/非根际土壤微生物群落多样性的差异

基于OTUs的水平，利用多样性指数进一步分析比较报春苣苔根际/非根际微生物群落多样性的差异，α-多样性结果见表2。从表2中可以看出，报春苣苔根际/非根际微生物群落中的菌群覆盖率是没有显著性差异的，测序结果很好且无差异地反映了微生物群落。报春苣苔根际/非根际细菌群落的Shannon指数、Chao1指数和ACE指数存在显著性差异，且报春苣苔根际细菌的α-多样性显著高于非根际；说明报春苣苔根际细菌菌群种类数量高于非根际土壤，报春苣苔的根系生长有利于细菌群落多样性的升高。同时，报春苣苔根际/非根际真菌群落的PD_whole_tree指数存在显著差异性，报春苣苔根际真菌群落的群体进化距离小于非根际的，说明非根际真菌群落进化更高。而报春苣苔根际/非根际细菌群落α-多样性指数显著高于真菌群落的，说明土壤细菌群落种类数量均远多于真菌群落。同时，土壤真菌群落的群体进化高于细菌群落的，说明真菌的群落进化分离程度高于细菌群落。

表2 α-多样性分析Table 2 α-diversity analysis

总体来看，报春苣苔根际土壤微生物多样性高于非根际土壤，这可能是由于植物生长分泌的可溶性根系分泌物影响微生物的生长进化，促进根际微生物群落的变化。报春苣苔根际对土壤微生物群落的影响是巨大的。

2.4 土壤钙对根际微生物群落的影响

喀斯特地区土壤钙含量高，报春苣苔是喀斯特地区适钙植物之一。为了讨论土壤微生物与报春苣苔根际适应高钙的作用，本研究采用蒙特卡罗置换检验分析土壤微生物群落与土壤钙含量与土壤微生物群落之间的相关性，结果表明，土壤钙含量和物种分布的相关性不显著(P=0.539)；进一步利用斯皮尔曼等级相关系数分析各个门细菌丰度与土壤钙含量之间的关系，结果发现，只有Hydrogenedentes门细菌与土壤钙含量显著正相关(r=0.85,P=0.031)，这说明土壤钙含量对于报春苣苔根际/非根际微生物群落的影响非常有限，报春苣苔根际微生物群落和报春苣苔根系生长具有更为紧密的关系。

3 讨论

根际微生物群落结构多样性与植物根系分泌物和其他植物有机物质有关[24-25]，且根系分泌物会导致某些类群的微生物大量繁殖，同时抑制其他微生物的生长[26]。根际微生物和植物种类、植物成分、土壤类型、土壤含水量等因素都有关系[27-30]。目前的研究发现，有的植物有利于富集根际微生物提高根际微生物群落多样性，例如美人蕉[31]；而有的植物根际土壤微生物群落多样性低于非根际土壤，例如水稻[32]。同时还有研究表明，根际微生物的多样性高于或低于非根际微生物，这和季节有关[33-34]。本研究发现，适钙植物报春苣苔的根际有利于细菌的富集，细菌群落多样性显著高于非根际土壤微生物。且报春苣苔富集微生物的同时，还会富集有益细菌，例如小梨形菌属(Pirellula)，它对氮循环具有十分重要的作用[35]。

不同植物的根际微生物群落之间差异很大。目前研究发现，玉米的根际土壤和表层土壤的优势细菌群落为变形菌门、Anaerolineae和酸杆菌门[36]；草莓的根际细菌优势菌群为变形菌门、拟杆菌门[37]；烟草根际细菌优势菌群为变形菌门、拟杆菌门和酸杆菌门[38]；施肥百合根际细菌优势菌群为变形菌门、酸杆菌门和芽单胞菌门，真菌优势菌群为子囊菌门[39]；枸杞子根际优势真菌为子囊菌门和接合菌门[30]。本研究首次揭示了适钙植物报春苣苔的根际细菌优势群落为变形菌门、酸杆菌门和放线菌门，真菌的优势群落为子囊菌门、担子菌门和接合菌门。变形菌门和子囊菌门是所有植物根际土壤微生物中共存的优势菌门，说明在微生物群落差异的大背景下，植物根际微生物中还会有一定的共性存在，这为研究植物根际-微生物之间共性的互作机制影响提供了支撑，也表明要对适钙植物根际-微生物群落互作机理的研究需要更多的数据，本研究仅仅才是开始。