皮肤黑色素瘤中PITX1表达及其与临床病理特征和预后的关系

赵滨，阴亚坤

（1.河南省直第三人民医院，河南郑州450000；2.郑州大学第一附属医院，河南郑州450000）

皮肤黑色素瘤（Cutaneous malignant melanoma，CMM）又称皮肤恶性黑色素瘤，是一种发生于皮肤黑色素细胞或痣细胞的恶性肿瘤，有恶性程度高、易发生远处转移、患者预后差、死亡率高等特点[1]。亚洲地区CMM的发病率低于欧洲、美澳等地区，但由于我国人口基数大，罹患CMM的总人数较多[2]。近年来我国CMM发病率逐年增长，且趋于年轻化[3]。目前，有关CMM发生机制尚不完全明确，因此，探究CMM发生、发展机制，对改善患者预后有重要因此意义。垂体同源框1（Pituitary homeobox 1，PITX1）作为一种转录因子，参与抑制细胞中端粒逆转录酶的转录激活，影响细胞增殖和细胞分化[4]。研究表明，PITX1在肿瘤细胞中表达下调或基本不表达，引起Ras等癌基因异常表达，导致肿瘤细胞异常增殖[5]。因此本研究采用免疫组织化学法检测CMM组织和正常皮肤组织中PITX1的表达情况，以探讨PITX1表达与CMM临床病理特征及预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 临床资料 回顾性分析2012年1月—2014年2月我院诊治的43例CMM患者临床资料，均经组织病理学检查确诊为CMM。其中男25例，女18例；平均年龄（55.47±13.51）岁。按照Clark分级标准对CMM肿瘤细胞浸润皮肤的深度进行判断[6]，按照美国癌症分期联合会制定的第7版TNM分期系统对CMM病理分化进行分期[7]。

纳入标准：①首次确诊为CMM患者；②经病灶切除活检确诊为CMM患者；③均具备完整的病例资料。

排除标准：①排除CMM复发患者；②术前行放化疗或合并其它恶性肿瘤转移患者；③排除确诊前治疗情况不明患者；④合并皮肤病或免疫缺陷疾病，合并糖尿病、高血压、冠心病等其他疾病患者；⑤排除眼脉络膜、口鼻腔等部位的黏膜黑色素肿瘤患者；⑥排除临床或随访资料不完整患者。

选取同期在因外伤在本院进行整形手术的皮肤正常患者37例作为对照，其中男21例，女16例，平均年龄（53.14±14.80）岁，均未合并皮肤病、心脑血管疾病、糖尿病、其他恶性肿瘤转移等。2组患者一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），有可比性。本研究经医院伦理委员会审查并批准，标本的采集、研究过程均不违背赫尔辛基宣言。见表1。

表1 CMM患者一般资料 例

1.1.2 主要试剂与仪器 Trizol试剂，购自Invitrogen公司；AceQ qPCR SYBR®Green Mix，购自上海英骏生物公司；一抗（anti-PITX1）、二抗、免疫组化SP试剂盒及苏木素染色剂，购自福建迈新生物公司；qRT-PCR仪，MJ RESEARCH-MiniCycler；超低温冰箱：海尔；普通光学显微镜，购自日本Olympus公司；石蜡切片机等，购自德国MICROM公司，等。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 均于术中收集皮肤组织，做好标记，切成小块（1.0×1.0×1.0 cm3/块），置于10%甲醛溶液中固定，制备石蜡切片。

1.2.2 免疫组织化学法检测PITX1表达 石蜡切片进行脱蜡、水化处理，采用免疫组化法检测PITX1蛋白水平，严格按照操作说明进行实验。①加入0.3%H2O2，孵育20 min；②修复组织；③加入PITX1一抗抗体稀释液，1∶200，4℃冰箱内过夜反应；④磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次，10 min/次；⑤加入稀释后带有生物素标记的二抗（1∶2 300），常温环境中孵育40 min；⑥PBS冲洗3次，加入链霉素抗生物蛋白-过氧化物酶溶液，常温环境中孵育30 min；⑦PBS冲洗3次，加入二氨基联苯胺（DAB）试剂，直至显色至预期深浅；⑧加入哈瑞（Harris）苏木素染色剂进行免疫荧光染色；⑨进行梯度脱水、透明处理，中性胶封片。采用光学显微镜下分析染色结果。

PITX1染色结果判断：每张切片随机选取10个高倍镜视野（×200）进行观察，阳性染色表现为细胞核中出现黄色或棕黄色颗粒，采用评分方法：①按细胞的染色程度分级评分：未着色计0分，呈浅黄色计1分，呈棕黄色计2分，呈棕褐色计3分；②按阳性细胞面积/阴性细胞面积比值进行评分：≤10%的视野计1分，11%～50%的视野计2分，51%～75%的视野计3分，＞75%的视野计4分。采用积分法，最终得分=染色得分×（阳性细胞面积/阴性细胞面积比值），对染色结果进行判定：1～3分评定为阴性或弱阳性，记作“-”；＞3分评定为阳性，记作“+”。染色结果由2位资深病理师判定。

1.2.3 随访 电话随访3年，随访截止时间：2017年4月30日，以死亡为随访终止。

1.3 统计学分析 计量资料以均数±标准差表示，2组间比较采用t检验；计数资料采用率表示，2组间比较使用卡方检验；采用Log-rank检验比较PITX1不同表达水平患者的生存率差异，借助GraphPad Prism绘制Kaplan-Meier生存曲线；CMM患者预后的独立危险因素采用COX回归模型分析。当P＜0.05时表示差异有统计学意义。采用SPSS 22.0进行统计学分析。

2 结果

2.1 不同皮肤组织中PITX1蛋白表达情况 免疫组化结果显示，PITX1蛋白位于组织细胞核，阳性染色呈棕黄色见图1 A。CMM患者皮肤组织中PITX1阳性表达率为25.58%，显著低于正常皮肤组织中PITX1阳性表达率97.30%，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

图1 PITX1蛋白在不同皮肤组织中的表达情况（免疫组织化学法染色×200）

表2 不同皮肤组织中PITX1蛋白表达水平比较结果 例

2.2 PITX1表达与CMM患者临床参数之间的关系PITX1相对表达水平与患者肿瘤溃疡情况、坏死情况、Breslow厚度、Clark分级、TNM分期、淋巴结转移等有关，差异均有统计学意义（P＜0.05），PITX1蛋白阳性患者与阴性患者年龄、性别对比差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 PITX1表达与患者临床参数之间的关系 例

2.3 PITX1表达与患者生存率之间的关系 PITX1表达阳性者3年存活率为90.91%（10/11），显著高于PITX1表达阴性者3年存活率46.88%（16/32），差异有统计学意义（χ2=0.022，P＜0.05）。见图2。

图2 PITX1表达与患者生存率之间的关系

2.4 影响CMM患者预后的COX单因素分析 本研究将患者PITX1表达、性别、年龄、肿瘤溃疡状态、坏死情况、Breslow厚度、Clark分级、TNM分期、淋巴结转移等因素，纳入影响CMM患者预后COX回归分析模型。单因素分析发现，PITX1表达、肿瘤坏死情况、Clark分级、TNM分期、淋巴结转移均是影响CMM患者预后的危险因素。见表4。

2.5 影响CMM患者预后的COX多因素分析 以CMM患者死亡为因变量，将2.4中差异显著的5个因素PITX1表达、坏死情况、Clark分级、TNM分期、淋巴结转移作为自变量，COX多因素分析显示，TNM分期、PITX1表达是影响患者死亡的独立危险因素。见表5。

表4 影响皮肤患者预后COX单因素分析结果

表5 影响皮肤患者预后COX多因素分析结果

3 讨论

黑色素瘤是一种恶性程度较高的肿瘤，在亚洲人群中，约50%～70%黑色素瘤原发于皮肤。近年来，随着医疗检测水平的提高，我国CMM的发病率逐年增加，每年增加高达2万例以上[8]。晚期CMM出现病灶局部浸润和远处转移，严重影响扩大切除术治疗疗效，对免疫疗法和放化疗耐受，患者死亡率较高[9]。因此，探索CMM的发病机制，寻找有效生物分子标记，可为CMM的临床治疗提供新思路。

肿瘤发病机制复杂，遗传、环境等因素均可影响其发病。有研究指出，机体接触致癌物后，某一细胞在基因水平上生长调控失常，使细胞增殖与凋亡出现异常，导致细胞恶化，从而引发癌变[10]。PITX1位于是一种与黑素细胞皮质素原基因表达有关的基因，参与肢体发育过程[11]。研究发现，PITX1作为一种特殊的转录调节因子，不仅有抑制细胞中端粒逆转录酶转录激活，影响细胞增殖和细胞分化的作用，而且有抑制癌基因Ras转录活性的作用[12]，提示PITX1可能参与肿瘤的发生过程。Libório等[13]采用原位杂交技术检测发现，PITX1在口腔鳞状细胞癌组织中表达下调，与肿瘤恶性程度有关。何文武等[14]发现，非小细胞肺癌组织PITX1基因阳性表达率为24.18%，明显低于良性肺组织PITX1基因阳性表达率66.67%，且与肿瘤组织分化和淋巴结转移情况有关，推测PITX1可能参与非小细胞肺癌的发生和发展，表明PITX1可能作为抑癌基因参与恶性肿瘤的发病过程。本研究对43例CMM患者皮肤组织标本进行检测，发现仅有11例PITX1表达阳性者，阳性表达率为25.58%，显著低于正常皮肤组织中PITX1阳性表达率97.30%，表明PITX1在CMM组织中表达下调，与Osaki等[15]发现一致，提示PITX1可能作为抑癌基因参与CMM的发生，与PITX1在其他恶性肿瘤中作用模式一致。进一步研究发现，有淋巴结转移、有溃疡发生和有坏死情况的患者PITX1表达阳性率显著低于无淋巴结转移、无溃疡发生和无坏死情况的患者；PITX1在肿瘤组织中阳性表达率随患者TNM分期、Clark分级及Breslow厚度的升高而逐渐降低，表明PITX1表达与患者TNM分期、Clark分级、Breslow厚度、淋巴结转移、溃疡状态和坏死情况有关，提示PITX1参与CMM疾病的发展，与疾病的恶性程度有关。

CMM的诊断和治疗方法虽取得一定进步，但死亡率仍较高[16]。因此，寻找有效生物标志物判断CMM患者预后情况，对指导临床治疗有一定意义。Knösel等[17]发现，PITX1在结直肠癌肿瘤组织中表达下调，与患者生存期缩短独立相关，可作为判断预后的指标。Nakabayashi等[18]发现，PITX1低表达的口腔上皮发育不良患者恶性转化的发生率显著高于PITX1高表达患者，可作为预测口腔上皮异常增生预后的生物标志物。Kong等[19]发现，PITX1在骨肉瘤组织中相对表达量显著低于正常骨组织，其表达水平与骨肉瘤患者的生存时间、肺转移密切相关，进一步分析发现，PITX1高表达是骨肉瘤患者预后的有利因素。Takenobu等[20]发现，头颈鳞状细胞癌患者中PITX1高表达者的化疗有效率明显高于PITX1低表达者，提示PITX1表达可作为预测多种恶性肿瘤预后情况的生物标志。本研究发现PITX1阳性表达的CMM患者3年存活率显著高于PITX1表达阴性者3年存活率。本研究发现发现，PITX1表达、肿瘤坏死情况、Clark分级、TNM分期、淋巴结转移均是影响CMM患者死亡的危险因素。将PITX1表达、坏死情况、Clark分级、TNM分期、淋巴结转移作为自变量，以患者死亡为因变量，COX多因素分析结果，PITX1表达、TNM分期是影响患者预后的独立危险因素。表明PITX1低表达是影响CMM患者的生存率下降的重要因素，是导致CMM患者死亡的独立危险因素。据此推测，检测CMM组织中PITX1表达情况可用于评估患者预后。

综上所述，PITX1在CMM患者中低表达，与CMM患者TNM分期、Clark分级、Breslow厚度、淋巴结转移、溃疡状态和坏死情况有关，对患者3年生存率有一定影响。推测PITX1表达水平可用于评估CMM恶性程度和患者预后，为有效的生物标志物。