盐酸多奈哌齐对阿尔茨海默病大鼠的影响

梁搏纳

(吉林省人民医院神经内科，吉林 长春 130021)

阿尔茨海默病(AD)是一种较为常见的脑变性疾病，其确切的病理损伤机制仍尚未清楚。目前，已明确AD患者的学习记忆功能减退可能是由于脑内的胆碱能神经元功能受损而造成的〔1〕。基于此，有学者认为〔2〕：盐酸多奈哌齐治疗AD具有较好的疗效，但对于其作用机制仍需进一步研究。另外也有研究〔3〕证实了：淀粉样β蛋白(Aβ)沉积，破坏了突触完整性，影响了其功能和可塑性。突触致密区蛋白95蛋白是突触后致密区内含量最多的一种蛋白，在突触可塑性中发挥着重要作用。但对于盐酸多奈哌齐是否会影响突触可塑性尚无学者进行研究。本研究以动物模型为研究对象，探讨了盐酸多奈哌齐对AD大鼠上述因子的影响，以便为AD的治疗提供一种较为有效的治疗药物。

1 材料与方法

1.1材料及分组 以18只正常老年雄性Wistar大鼠〔汇智泰康生物技术(北京)有限公司提供，许可证编号：SYXK(京)2014-0022〕为研究对象，均为19～24月龄，体重450～550 g，平均(502.3±12.5)g。将18只大鼠随机分为3组，分别为对照组、模型组及治疗组，每组6只。实验过程中动物可自由摄食及饮水。

1.2试剂与仪器 上海北诺生物科技有限公司的Aβ25～35，上海宝曼生物科技有限公司的碘化丙啶(PI)染色液，赛默飞公司的核糖核酸酶(RNase)、兔抗大鼠Aβ1～40、 丙二醛(MDA)试剂盒、羊抗兔的二抗，索莱宝公司的乙酰胆碱酯酶(AchE)、丁酰胆碱酯酶(BchE)和超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒，柠檬酸三钠还原硝酸银(AgNO3)，北京诺博莱德科技有限公司提供的中杉金桥PV9000通用型二步法检测试剂盒，北京梅科万德生物科技有限公司提供的DAB显色剂，香港西夏公司提供的图像分析仪(软件系统Visilog5.0)，沈阳誉德电子仪器有限公司提供的SYD-K4080型全自动恒温冷冻切片机；先仪谱科技提供脑立体定位仪，江苏赛昂斯公司提供的Morris水迷宫。

1.3建立模型 制备聚集态的Aβ后，模型组和治疗组建立AD模型：适应性喂养1 w，100 g/L的水合氯醛腹腔注射麻醉，固定于脑立体定向仪，减去头顶部毛发，碘酊消毒，75%酒精脱碘，头顶部正中切口，暴露前囟，依据定位图谱，钻开颅骨，暴露硬脑膜，微量注射器穿刺，注入5 μl聚集态的Aβ25～35，留针10 min，局部撒复方新诺明，缝合切口，碘伏消毒。大鼠术后愈合后，给予3%氯化铝100 mg/kg灌胃，持续1个月。

对照组同上步骤，不同的是注射器注入等容积的生理盐水。

1.4方法 3组大鼠在造模后3 d开始灌胃给药，1次/d，治疗组给予盐酸多奈哌齐(商品名：阿瑞斯，厂家：陕西方舟制药有限公司；批准文号：国药准字H20030583)0.525 g/kg，对照组及模型组给予等量的生理盐水灌胃。连续灌胃4 w。

1.5观察指标

1.5.1学习能力及空间记忆能力 在灌胃结束后，以大鼠Morris水迷宫实验测试分析〔4〕，包括学习能力、空间记忆能力，空间探索实验。

1.5.2血清AchE、BchE活性 麻醉，腹主动脉取血3 ml，离心，取血清测定AchE、BchE活性。

1.5.3脑组织中SOD、MDA含量及细胞凋亡情况 麻醉取血，快速断头，取出全脑，分离大鼠大脑右侧后1/4皮质，称重，生理盐水制成脑组织匀浆(10%)，按照试剂盒测定SOD、MDA含量。

取出全脑，分离大鼠大脑右侧前1/4皮质，浸泡冰乙醇(70%)中，制成单细胞悬液，PI染色，以流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.5.4不同脑组织区域的Aβ表达 取出全脑，将左侧额叶、颞叶和海马组织浸泡至甲醛溶液(10%)中，石蜡包埋、切片，Aβ免疫组化和银染色。

1.5.5大鼠脑内海马CA1区、皮质突触后致密区蛋白95表达变化 观察所有大鼠脑内海马CA1区、皮质突触后致密区蛋白95阳性细胞：免疫组化切片，10×10显微镜观察，Visilog5.0 by Noesis软件采集并分析图像，记录阳性细胞平均面积及平均吸光度。

1.6统计学分析 采用SPSS21.0软件进行t检验、Fisher确切概率法。

2 结 果

2.13组学习能力及空间记忆能力比较 在第1～4天，治疗组、对照组逃避潜伏期均明显短于模型组，而治疗组、对照组空间探索实验结果明显低于模型组(P<0.05)，见表1。

2.23组血清AchE、BchE活性比较 对照组、治疗组血清AchE活性均显著低于模型组(P<0.05)，对照组BchE活性显著低于模型组(P<0.05)，治疗组、模型组BchE活性无明显差异(P>0.05)。见表2。

2.33组脑组织中SOD、MDA含量及细胞凋亡情况比较 治疗组、对照组脑组织中SOD含量显著高于模型组，MDA含量及细胞凋亡情况显著低于模型组(P<0.05)，见表3。

表1 3组学习能力及空间记忆能力比较

与模型组相比:1)P<0.05；下表同

表2 3组血清AchE、BchE活性比较

表3 3组脑组织中SOD、MDA含量及细胞凋亡情况比较

2.43组左侧额叶、颞叶和海马组织区域的Aβ表达量比较 治疗组、对照组左侧额叶、颞叶和海马组织区域的Aβ表达量显著低于模型组(P<0.05)，见表4。

2.53组脑内海马CA1区、皮质突触后致密区蛋白95表达比较 治疗组、对照组脑内海马CA1区、皮质突触后致密区蛋白95表达显著高于模型组(P<0.05)，见表5。

表4 3组左侧额叶、颞叶和海马区域的Aβ表达量比较

表5 3组脑内海马CA1区、皮质突触后致密区蛋白95表达比较

3 讨 论

AD的流行病学显示〔5〕：我国65岁以上老年人有3%～7%的人群患病。其病因尚未明确，但有研究发现〔6〕：AD的典型组织病理学改变为脑内的淀粉样蛋白沉积，而中枢胆碱能神经元功能受损可能会导致患者的学习、记忆受损。盐酸多奈哌齐是一种AchE抑制剂，能够改善AD的学习、记忆功能，但对于其作用机制尚未明确。

本研究建模及干预方式与何建明等〔7〕相一致。本研究结果表明，AD能够导致大鼠体内的AchE活性升高，而治疗组之所以和对照组差异不显著，则是盐酸多奈哌齐发挥了作用，推断可能是这一药物促使AchE活性降低。模型组和治疗组的BchE活性均高于对照组，模型组和治疗组的BchE活性无明显差异，提示AD患者的BchE活性升高，而盐酸多奈哌齐对于BchE活性，不会产生较为明显的影响。乙酰胆碱是胆碱能系统中的主要递质，在突触处，如发生水解，会同时活化AchE、BchE，终止神经递质功能。AchE活化后能够促进Aβ沉积，且有研究证实〔8〕，AchE-Aβ复合物的神经毒性明显大于单独的Aβ肽，同时Aβ能够升高AchE的活性。SOD是一种抗氧化金属酶，能够平衡体内的氧化与抗氧化，其含量能够反映机体的抗氧化能力。MDA是膜脂过氧化最重要的一种产物，能够加剧膜的损伤，因此可将其作为反映氧自由基水平的指标。本研究结果证实：AD可降低脑组织中SOD含量，升高Aβ表达量及MDA含量，而盐酸多奈哌齐则能够通过乙酰胆碱与Aβ之间的密切关系，有效降低脑内组织的Aβ表达量，进而减少脑内氧自由基的产生，降低MDA含量，升高SOD含量。此外，模型组的细胞凋亡比例明显高于对照组及治疗组，这一结果证实，盐酸多奈哌齐可减少细胞凋亡比例，进而增加患者的逃避潜伏期。经空间探索实验发现，对照组与治疗组空间探索实验结果均明显低于模型组，可见AD模型组大鼠的空间记忆能力降低，对照组与治疗组空间探索结果差异不明显，说明盐酸多奈哌齐能够明显改善大鼠的学习及空间记忆能力。目前主要将AD的学习、记忆障碍归因于胆碱能神经递质的缺乏。盐酸多奈哌齐能够降低AchE活性，使得乙酰胆碱浓度增加，进而改善其学习记忆功能。有研究显示〔9〕，淀粉样蛋白的产生与聚集是导致AD发病的中心环节，在发病早期，突触的功能与结构受损主要是由于Aβ导致的，导致突触的可塑性(多种学习形式的基础)丧失，导致认知损害。突触后致密区主要位于中枢神经系统的突触后模，具有调节和聚合受体、稳定突触结果的作用，而突触后致密区蛋白95是突触后致密区最为丰富的一种蛋白，与突触后膜相隔12 nm，与多种离子通道受体、因子、蛋白等联系密切，还能够与其他许多胞质信号组成信号复合物，促进信号耦合，影响突触传递及可塑性。本研究中，模型组大鼠脑内海马CA1区、皮质突触后致密区蛋白95表达明显低于对照组和治疗组，提示AD大鼠的突触可塑性降低，而盐酸多奈哌齐能够提高突触后致密区蛋白95表达水平，进而改善突触的可塑性，改善认知功能。上述研究数据均证实，盐酸多奈哌齐能够通过多种方式，改善AD的症状，进而提高治疗效果。