大强度运动对大鼠脾脏淋巴细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞亚群的影响

李鸿敏 周碎平 华岩

(1河南警察学院洛阳校区，河南 洛阳 471002；2重庆师范大学涉外商贸学院；3南宁师范大学体育与健康学院)

脾脏是机体最大的免疫器官，含有大量的巨噬细胞与淋巴细胞，能清除血液中病毒、异物、衰老死亡细胞等，此外，脾脏还制造补体、免疫球蛋白等。长期大强度运动会影响脾脏免疫功能，例如淋巴细胞数量减少、巨噬细胞活性降低等〔1，2〕。所以，常有运动员在比赛或者训练后，机体免疫功能下降，对病毒的抗感染能力降低，易患感冒、呼吸道感染、病毒肝炎等疾病，严重影响后续的比赛和训练。因此，了解大强度运动后脾脏免疫功能的变化特征，对今后的比赛与训练具有重要的意义。目前研究中，较少观察运动后恢复期间脾脏淋巴细胞、T淋巴细胞亚群、巨噬细胞的动态变化特征。本研究，拟通过建立大鼠长期大强度运动模型，探讨运动后恢复期间大鼠脾脏淋巴细胞、T淋巴细胞亚群、巨噬细胞的变化，旨在为大强度运动后免疫功能的变化规律提供实验依据

1 对象与方法

1.1实验对象与分组 健康雄性SD大鼠45只，2月龄动物房内分笼饲养，每笼5只，喂食国家标准啮齿类饲料。动物房湿度40%～60%，温度25℃±2℃。实验前，进行为期7 d的适应跑台练习，每天10 min，定速10 m/min，期间淘汰5只不肯跑大鼠，剩余大鼠40只(体重192 g±22.1 g)。

大鼠随机分两组：安静组(A组，n=10)，运动组(B组，n=30)。训练末期，运动组大鼠因为训练不当死亡3只。在最后一次力竭运动后，根据不同取材时间，将运动组小鼠分为B1组(运动后即刻取材)、B2组(运动后12 h取材)，B3组(运动后24 h取材)，每组9只。

1.2实验方法

1.2.1主要仪器 台式电子体重称(上海精密科学仪器有限公司)、电子天平(上海精密科学仪器有限公司)、跑台(江苏赛昂斯生物科技)、超净工作台(苏州安泰技术有限公司)、酶标仪(BIO-RAD，美国)、96孔细胞培养板(美国)、24孔细胞培养板(美国)、CO2细胞培养箱(SANYO，日本)、流式细胞仪(美国Beckman-coulter公司)等。

1.2.2主要试剂 脂多糖(LPS，购于美国Sigma公司)、RPMII640培养液(购于南京建成生物研究所)、磷酸盐缓冲液(PBS，自配)、生理盐水(自配)、噻唑蓝(MTT，购于Amresco公司)、二甲基亚砜(DMSO，购于美国Amresco公司)、淋巴细胞分离液(购于中生北控生物科技股份有限公司)、CD4+、CD8+单克隆抗大鼠抗体(购于南京建成生物研究所)、刀豆蛋白A(ConA，购于美国Sigma公司)、中性红(南京建成生物研究所)等。

1.2.3运动方案 A组：正常饮食、进水，不运动。

运动组：运动方案参考国内外学者〔3，4〕并加以改进。训练9 w，每周6 d，周日休息，前8 w为递增负荷训练，第9周为力竭训练(力竭判定：大鼠臀部压笼子后端，后肢滞后与跑台皮带转速约30 s，跟不上跑台速度，对大鼠刺激、驱赶无效。)。第1周，速度18 m/min，坡度0%，时间20 min/d；第2周，速度22 m/min，坡度2%，时间20 min/d；第3周，速度25 m/min，坡度5%，时间20 min/d；第4周、第5周，速度28 m/min，坡度5%，时间30 min/d；第6周，速度28 m/min，坡度8%，时间50 min/d；第7周、第8周，速度32 m/min，坡度10%，时间50 min/d；第9周，速度32 m/min，坡度10%，力竭。

1.2.4动物取材、脾脏淋巴细胞悬液的制备与指标的测定 动物取材：末次训练后，A组、B1组大鼠轻度麻醉，称重，无菌条件下摘除大鼠脾脏，剔除脾脏的结缔组织与脂肪组织。B2组、B3组取材时间为运动后12 h、运动后24 h。

脾脏淋巴细胞悬液的制备：将脾脏研磨(采用200目不锈钢滤网)，倒入含有PBS的培养皿中，以1 500 r/min，离心3 min后，取脾细胞沉淀。脾细胞沉淀加入红细胞裂解液，以2 000 r/min离心20 min，去上清，取细胞悬液。用PBS洗涤2次脾细胞悬液，染液染色3 min，在活细胞数大于95%，RPMII640培养液制备脾细胞悬液(计数细胞后调整所需浓度为1×107细胞/ml)。制备的淋巴细胞悬液用于T淋巴细胞增殖能力、B淋巴细胞增殖能力、CD4+、CD8+细胞数；脾脏巨噬细胞吞噬能力的测定。

指标的测定：MTT法分别检测大鼠脾脏T淋巴细胞增殖能力、B淋巴细胞增殖能力；流式细胞仪检测CD4+、CD8+细胞数；中性红比色法测定脾脏巨噬细胞吞噬能力。

1.3统计学分析 采用SPSS17.0进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1各组T淋巴细胞增殖、B淋巴细胞增殖比较 与A组相比，B1组、B2组T淋巴细胞增殖、B淋巴细胞增殖显著降低，差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01)，B3组T淋巴细胞增殖、B淋巴细胞增殖略低，差异无统计学意义；与B1相比，B2组、B3组T淋巴细胞增殖、B淋巴细胞增殖显著升高，差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01)；与B2组相比，B3组T淋巴细胞增殖、B淋巴细胞增殖显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组T淋巴细胞增殖、B淋巴细胞增殖比较

与A组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与B1组比较：3)P<0.05，4)P<0.01；与B2组比较：5)P<0.05，6)P<0.01；下表同

2.2各组T淋巴细胞亚群比较 与A组相比，B1组CD4+、CD8+、CD4+/CD8+显著降低，差异有统计学意义(P<0.01、P<0.05)，B2组CD4+、CD4+/CD8+显著降低，差异有统计学意义(P<0.01、P<0.05)，CD8+差异无统计学意义，B3组CD4+、CD8+、CD4+/CD8+差异无统计学意义；与B1组相比，B2组、B3组CD4+、CD8+、CD4+/CD8+显著升高，差异有统计学意义(P<0.01、P<0.05)；与B2组相比，B3组CD4+显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)，CD8+、CD4+/CD8+差异无统计学意义，见表2。

表2 各组CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比较

2.3各组脾脏巨噬细胞、自然杀伤细胞比较 与A组(0.42±0.07)相比，B1组巨噬细胞吞噬能力显著降低，差异有统计学意义(0.30±0.05，P<0.01)，B2组(0.39±0.05)、B3组(0.42±0.05)巨噬细胞吞噬能力差异无统计学意义；与B1相比，B2组、B3组巨噬细胞吞噬能力显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与B2组相比，B3组巨噬细胞吞噬能力差异无统计学意义。

3 讨 论

大强度运动导致机体免疫功能受到抑制〔1，2，5〕。本研究前8 w为递增负荷训练，第9周为力竭运动，根据Bedford等〔3〕的研究推断(不同的速度、坡度与摄氧量之间的关系)，第1～5周的运动速度为18～28 m/min，坡度为5，时间20～30 min，小于65%最大吸氧量；第6周速度28 m/min，坡度为8，时间50 min，大于85%最大吸氧量；第7～8周，运动速度32 m/min，坡度为10，时间50 min，大于95%最大吸氧量；第9周，力竭运动，应属于100%最大吸氧量。训练结束后，B组T淋巴细胞增殖能力、B淋巴细胞增殖能力、CD4+/CD8+比值、巨噬细胞吞噬能力，均显著降低，结果表明，大鼠脾脏免疫功能受到抑制。

脾脏中B淋巴细胞主要介导体液免疫(产生抗体，提呈抗原及分泌细胞内因子参与免疫调节)，T细胞主要介导细胞免疫(抗胞内感染、瘤细胞与异体细胞等)〔6,7〕。T细胞的许多功能是通过其亚群发挥作用的，例如，CD8+(毒性T细胞)直接杀伤或者抑制被病毒感染的靶细胞。CD4+(辅助性T细胞)分泌的细胞因子抗病毒、肿瘤〔8〕。研究认为，随着运动时间、运动强度的增加，机体的胸腺、脾脏会发生形态和功能的改变，脾脏的萎缩会损坏骨髓结构的变化，直接损害淋巴细胞的发源地，表现为淋巴细胞增殖能力降低，CD8+、CD4+、CD4+/CD8+显著降低等〔9～14〕。

本研究结果提示，大强度运动导致大鼠免疫功能受到抑制，脾脏T淋巴细胞增殖、B淋巴细胞增殖、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+降低，恢复期间逐步上升，其中CD8+、CD4+/CD8+在恢复12 h基本达到正常状态，T淋巴细胞增殖、B淋巴细胞增殖、CD4+在24 h达到正常状态。也有报道表明，急性递增负荷后，T淋巴细胞水平及CD4+/CD8+显著下降，在24 h后T淋巴细胞水平及CD4+/CD8+达正常状态〔15〕。

巨噬细胞是重要的免疫细胞，具有吞噬病毒、杀伤、抗原递呈、分泌等作用有研究认为，大强度运动导致巨噬细胞的活性氧成分流失，巨噬细胞能力下降〔16,17〕。本研究结果提示，大强度运动导致大鼠脾脏中巨噬细胞吞噬能力降低，恢复期间12 h后基本达到正常水平。

综上，大强度运动后，大鼠脾脏、B淋巴细胞、T淋巴增殖能力降低、巨噬细胞吞噬能力降低、CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+降低，恢复期间逐步上升，其中CD8+、CD4+/CD8+、巨噬细胞吞噬能力在恢复期12 h基本达到正常状态，T淋巴细胞增殖能力、B淋巴细胞增殖能力、CD4+在恢复期24 h达到正常状态。