盐酸羟考酮通过JNK/p38MAPK信号通路调控异丙肾上腺素诱导的心肌细胞凋亡的机制

万敏 许美霞

(武汉市第四医院ICU，湖北 武汉 430030)

心力衰竭属于心血管疾病发展的终末阶段并可促使患者死亡，其主要由心脏重构、体液等异常造成的一种恶性循环〔1〕。研究表明心力衰竭发生过程涉及心肌细胞凋亡、肥大及血管新生等多个病理生理过程，其中心肌细胞凋亡发生时还可通过促进病理性细胞肥大及间质纤维化从而引发心肌重构〔2〕。因而如何抑制心肌细胞凋亡成为延缓心力衰竭的关键环节。羟考酮又称盐酸羟考酮，研究表明盐酸羟考酮可减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤从而对心肌细胞发挥保护作用〔3〕。羟考酮可能通过调控P53，B淋巴细胞瘤(Bax)和B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bcl)-2mRNA的水平和VEGF，uPA的表达而抑制肺癌A549细胞增殖及迁移，促进其凋亡〔4〕。但关于盐酸羟考酮对心肌细胞凋亡的作用尚未可知。异丙肾上腺素(ISO)属于β受体激动剂，研究表明ISO可增加心肌耗氧量而造成心肌缺血、坏死等，ISO诱导心肌细胞损伤并可促使心肌细胞凋亡，故可用ISO建立体外培养心肌细胞损伤模型〔5〕。抑制p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路激活可减轻缺氧复氧环境下心肌细胞凋亡及氧化损伤〔6〕。研究表明通过抑制c-Jun氨基末端激酶(JNK)/p38MAPK信号通路激活可减轻心肌细胞氧化损伤而保护心肌细胞〔7〕。目前关于盐酸羟考酮对心肌细胞损伤生物作用机制研究尚未完全阐明。因此，本研究通过检测盐酸羟考酮干预ISO诱导的心肌细胞损伤的凋亡相关指标而探讨盐酸羟考酮对损伤心肌细胞的抗凋亡作用，拟从心肌细胞凋亡角度探析盐酸羟考酮是否对ISO诱导的心肌细胞损伤有抗凋亡作用，并初步探究其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 大鼠心肌细胞H9c2购自美国ATCC细胞库。ISO购自美国Sigma公司；DMEM培养基与胎牛血清均购自美国Gibco公司；细胞凋亡检测试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；乳酸脱氢酶(LDH)与肌酸激酶(CK)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；噻唑蓝(MTT)购自美国ENZO公司；Bcl-2、Bax抗体均购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；磷酸化(p)-JNK、p-p38MAPK、JNK、p38MAPK抗体均购自美国CST公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的免疫球蛋白(Ig)G二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；盐酸羟考酮购自英国Hamol公司(规格：0.5 mg/kg，批号：AW092)；p38MAPK特异性抑制剂SB203580购自美国Sigma公司。

1.2方法

1.2.1药物处理及实验分组 取出冻存心肌细胞H9c2，细胞复苏，置于含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养，1 000 r/min转速离心机离心10 min，放入37℃、体积分数5%CO2培养箱培养，细胞传代(2～3代)，取对数生长期心肌细胞，胰蛋白酶消化细胞，调整细胞密度为5×103个/ml，接种于6孔板，用10 μmol/L的ISO处理心肌细胞48 h(ISO组)，未进行任何处理的细胞作为对照组〔8〕。1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L的盐酸羟考酮处理心肌细胞2 h〔9〕，用10 μmol/L的ISO处理心肌细胞48 h，分别为ISO+盐酸羟考酮1 μmol/L组、ISO+盐酸羟考酮5 μmol/L组、ISO+盐酸羟考酮10 μmol/L组。后续实验中为探究盐酸羟考酮是否通过调控JNK/p38MAPK信号通路而发挥作用，用15 μmol/L的JNK/p38MAPK信号通路阻断剂SB203580预处理24 h〔10〕，用10 μmol/L的ISO处理心肌细胞48 h，作为ISO+SB203580组。

1.2.2MTT检测细胞增殖 将心肌细胞按照3×105个/ml的密度接种于96孔板，每组设置3个复孔，分别取各组100 μl细胞悬液加入对应培养基内，放入37℃、5%CO2培养箱继续培养24 h、48 h、72 h，每孔分别加入10 μl MTT溶液，室温孵育4 h，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，每孔分别加入二甲基亚砜(DMSO)溶液150 μl，同时设置无细胞的空白孔加入等量DMSO溶液作为对照孔，低速振荡10 min，酶标仪检测各孔吸光度(OD 490 nm)细胞存活率(%)=〔(实验组-空白组)/(对照组-空白组)〕×100%。

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组心肌细胞，预冷PBS洗涤3次，使用0.25%胰蛋白酶消化细胞，收集细胞，低速离心后加入100 μl结合缓冲液制备单细胞悬液，依次加入5 μl Annexin V-FITC与PI，室温避光孵育10 min，加入300 μl结合缓冲液终止反应，充分混匀，应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4Western印迹检测Bcl-2、Bax及JNK/p38MAPK信号通路相关蛋白表达 收集各组对数生长期心肌细胞，弃细胞培养液，加入裂解液裂解，4℃条件下，14 000 r/min转速离心10 min，吸取蛋白上清液转移至无菌无酶的EP管内，采用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，取蛋白样品加入等体积的2×加样缓冲液，100℃煮沸5 min变性，取30 μg蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)反应，反应结束后将其转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室温条件下使用5%牛血清白蛋白封闭1 h，加入一抗(稀释比1∶800)，4℃反应24 h，加入二抗(稀释比1∶1 000)，室温孵育1 h，滴加增强型电化学发光试剂(ECL)显色，凝胶成像系统采集图像，应用Quantityone软件分析蛋白相对表达量(目的蛋白条带灰度值/内参照条带灰度值)。

1.2.5检测细胞上清液中LDH、CK含量 收集各组心肌细胞培养上清液，应用酶标仪检测LDH、CK含量，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3统计学处理 采用SPSS19.0软件进行t检验，方差分析，LSD-t检验。

2 结 果

2.1盐酸羟考酮对心肌H9c2细胞存活率的影响 用ISO处理心肌细胞后，与对照组比较，心肌细胞存活率显著降低(P<0.05)；与ISO组比较，不同浓度的盐酸羟考酮处理心肌细胞后，心肌细胞存活率显著升高(P<0.05)，见表1。由于盐酸羟考酮10 μmol/L处理后心肌细胞存活率相对较高，因此选取盐酸羟考酮10 μmol/L进行后续研究。

2.2盐酸羟考酮对心肌H9c2细胞凋亡率的影响 流式细胞仪检测不同处理条件下心肌细胞凋亡率变化，结果显示，与对照组比较，ISO组心肌细胞凋亡率显著增加(P<0.05)；与ISO组比较，ISO+盐酸羟考酮10 μmol/L组心肌细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。Western印迹实验结果显示，ISO组心肌细胞中Bax表达明显上调(P<0.05)，而Bcl-2表达明显下调(P<0.05)，盐酸羟考酮处理后ISO+盐酸羟考酮10 μmol/L组心肌细胞中Bax表达明显下调(P<0.05)，而Bcl-2表达明显上调(P<0.05)，见图1、表2。

表1 盐酸羟考酮对培养不同时间心肌H9c2细胞存活率的影响

与对照组比较:1)P<0.05；与ISO组比较:2)P<0.05，下表同

A：流式细胞仪检测各组心肌细胞凋亡；B：Western印迹法检测细胞凋亡相关蛋白表达；1～3分别为对照组、ISO组、ISO+盐酸羟考酮10 μmol/L组，图2同

表2 盐酸羟考酮对心肌H9c2细胞凋亡及上清液LDH、CK含量的影响

2.3盐酸羟考酮对心肌H9c2细胞上清液中LDH、CK含量的影响 与对照组比较，ISO组心肌细胞上清液中LDH、CK含量均显著升高(P<0.05)；与ISO组相比，ISO+盐酸羟考酮10 μmol/L组心肌细胞上清液中LDH、CK含量均显著降低(P<0.05)，见表2。

2.4盐酸羟考酮对心肌H9c2细胞JNK/p38MAPK信号通路相关蛋白表达的影响 与对照组比较，ISO组心肌细胞中p-JNK、p-p38MAPK蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)；与ISO组比较，ISO+盐酸羟考酮10 μmol/L组心肌细胞中p-JNK、p-p38MAPK蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)，见表3、图2。

表3 盐酸羟考酮对心肌H9c2细胞JNK/p38MAPK信号通路相关蛋白表达的影响

图2 Western印迹法检测各组心肌细胞中JNK/p38MAPK信号通路相关蛋白表达

2.5阻断JNK/p38MAPK信号通路对心肌H9c2细胞存活率及凋亡率的影响 与对照组比较，ISO组心肌细胞存活率显著降低，而细胞凋亡率显著升高，Bcl-2表达显著下降，Bax表达显著上调，差异有统计学意义(均P<0.05)。与ISO组比较，ISO+SB203580组心肌细胞存活率显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，而细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，Bcl-2表达上调，差异有统计学意义(P<0.05)，而Bax表达下调，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4、图3。

表4 阻断JNK/p38MAPK信号通路对心肌H9c2细胞存活率及凋亡率的影响

1～3：对照组、ISO组、ISO+SB203580组

3 讨 论

心肌细胞凋亡与心室重构均可加重心力衰竭，并可影响心房肌细胞凋亡及纤维化，细胞凋亡是心血管疾病、自身免疫性疾病等多种疾病发生的重要机制之一〔11〕。心肌细胞本身不具有增殖能力，随着心肌细胞凋亡数量增加明显减弱心脏收缩功能甚至诱发心力衰竭〔12〕。因此，通过某些措施干预心肌细胞凋亡过程中的相关信号通路或转导途径可为心血管疾病治疗提供新方向。

盐酸羟考酮属于阿片类药物，其可通过激活μ受体、κ受体而发挥镇痛作用，并可通过调控细胞因子或趋化因子等表达而调控机体免疫功能〔13〕。研究表明阿片类药物可通过调控癌细胞增殖及凋亡等途径进而发挥抗癌作用〔14,15〕。本研究结果与相关文献报道相似〔16〕。说明盐酸羟考酮可促进ISO诱导的心肌细胞存活而抑制其凋亡，其可能通过调控细胞凋亡相关蛋白表达进而发挥作用。提示盐酸羟考酮可有效抑制心肌细胞凋亡并促进其存活。研究报道指出心肌细胞或组织坏死时LDH、CK释放量增加，活性增强，预示心肌细胞损伤程度加重〔17〕。说明ISO可促使心肌细胞发生严重损伤，盐酸羟考酮可有效减轻ISO诱导的心肌细胞损伤。提示盐酸羟考酮具有抗氧化及减轻ISO诱导的心肌细胞损伤的作用。

心肌缺血再灌注损伤发生后心肌细胞内JNK/p38MAPK信号通路激活，各种炎性细胞因子生成量明显增加，进一步促进心肌细胞凋亡而加重心肌缺血再灌注损伤〔18〕。JNK/p38MAPK信号通路激活后可通过与底物结合而影响组织炎症反应、细胞增殖及凋亡等过程，研究表明JNK/p38MAPK信号通路活化与细胞凋亡有关〔19,20〕。本研究结果提示盐酸羟考酮可能通过抑制JNK/p38MAPK信号通路的活化进而减轻ISO诱导的心肌细胞损伤后炎症反应及细胞凋亡。进一步研究发现ISO诱导的心肌细胞中加入JNK/p38MAPK信号通路阻断剂，结果发现其对ISO诱导的心肌细胞损伤及细胞凋亡的作用与盐酸羟考酮的作用效果相似。提示盐酸羟考酮可能通过抑制JNK/p38MAPK信号通路的激活，抑制ISO诱导的心肌细胞氧化损伤，减少细胞凋亡，从而发挥对ISO诱导心肌细胞损伤的保护作用。

综上，盐酸羟考酮通过降低氧化应激水平及抑制ISO诱导的心肌细胞凋亡而保护心肌细胞，其可能通过抑制JNK/p38MAPK信号通路的激活而发挥作用，为临床治疗心力衰竭药物的研发及应用提供理论依据。