CCR5Δ32基因多态性在辽宁省老年系统性红斑狼疮诊断中的意义

张程 吴姗姗 吕丹 张婷婷 张艺凡

(辽宁中医药大学附属医院检验科，辽宁 沈阳 110032)

系统性红斑狼疮(SLE)是一种常见的累及多脏器的慢性炎症性自身免疫病，临床表现复杂〔1〕，发病率逐年增高，且女性比男性多发〔2〕。SLE发病机制复杂，受多重因素影响，包括基因、环境和趋化因子等，趋化因子受体在SLE炎症反应中的作用成为近年来热门的课题〔3〕。

趋化因子是由多种细胞分泌的具有可引起白细胞趋化特性的细胞因子，参与多种免疫性疾病及炎症性疾病的致病过程。趋化因子根据其蛋白中半胱氨酸残基的排列，可分为CXC型、CC型、C型和CX3C型四种〔4〕，CC型是炎性细胞典型的趋化因子〔5〕。趋化因子受体为7次跨膜G蛋白耦联受体蛋白，表达于免疫细胞表面〔6〕，根据结合趋化因子不同分为CXC型和CC型〔7〕。CCR5是CC类趋化因子的受体，通过调控T细胞和单核细胞来参与免疫反应〔8〕。CCR5编码基因位于人类3P21染色体短臂上，已发现该编码区出现缺失32 bp的基因型(CCR5Δ32/rs333)，该缺失导致纯合子个体表面无CCR5的表达，杂合子个体CCR5表达量下降〔9〕。

目前已有研究支持CCR5Δ32基因型个体对人类免疫缺陷病毒(HIV)-1耐受，其缺失的CCR5可以抵抗HIV对宿主细胞的攻击〔10〕，然而该基因型在自身免疫疾病中的作用仍存在争议。Pokorny等〔11，12〕研究认为CCR5Δ32可以降低类风湿关节炎的易感性，而Samson等〔9〕持反对意见。CCR5Δ32基因型对多发性硬化症的影响也同样存在争议〔13，14〕。目前认为CCR5Δ32基因型对SLE的影响根据人种、地域而发生变化〔5，15，16〕，但并没有针对老年人群中该指标与SLE关系的研究。本研究通过研究辽宁地区老年人群中CCR5基因多态性、SLE活动度相关检测指标，与对照组比较，来明确老年人群中SLE易感性及SLE活动度与CCR5基因多态性的关系。

1 材料和方法

1.1研究对象 辽宁中医药大学附属医院2017年1月至2018年9月门诊及住院SLE患者500例，其中女258例，男242例，年龄60～66岁，平均(63.2±2.5)岁。SLE诊断标准采用美国风湿协会SLE诊断标准(1982年制定)，符合该标准中4条者可确诊。对照组从辽宁中医药大学附属医院辽宁省体检正常老年人中抽取500例，其中女252例，男248例，平均年龄(64.5±3.8)岁。两组性别和年龄均无显著差异(P>0.05)。

1.2材料 PCR扩增试剂盒(天根生化科技有限公司)，抗核抗体(ANA)谱及dsDNA抗体检测试剂盒(欧盟)，琼脂糖凝胶电泳采用伯乐电泳槽。

1.3方法 ①临床指标检测：两组人群分别进行以下项目检查：基础检查包括发病年龄、身高、体重、体重指数(BMI)。SLE活动度评价指标(参照SLEDAI标准)包括血清C3、C4浓度(迈克生物，四川)，ANA滴度(>1∶100为阳性)(欧蒙，北京)，双链DNA抗体(欧蒙，北京)，外周血白细胞总数。②CCR5Δ32基因多态性检测：从新鲜外周血提取基因组DNA(天根DNA提取试剂盒)，PCR法扩增CCR5基因(天根PCR扩增试剂盒，引物正义链：ACCAGATCTCAAAAAGAA，反义链：CATGATGGTGAAGATAAGCTTCA)，25 μl反应体系中含有2.5 μmol/L dNTP 2 μl，2.5 μmol/L Mg2+1.5 μl，2.5 μmol/L正、反向引物各2.5 μl，5 U/μl Taq 0.25 μl，10 ng/μl模板10 μl，10×缓冲液2.5 μl，去离子水3.75 μl。反应条件：94℃预变性5 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，30个循环；72℃延伸7 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，目的片段为225 bp(野生株)和193 bp(突变株)。

1.4统计学分析 采用SPSS11.5软件进行χ2检验、Hardy-Weinberg检验。

2 结 果

2.1SLE组临床检测指标结果 SLE组≤SLEDAI 3条人数占57.4%，C3、C4浓度均值均在正常范围内，ANA滴度阳性61.6%，抗dsDNA抗体阳性66.0%。

2.2CCR5基因多态性结果判读 通过电泳鉴定可以直观分析出，CCR5为野生型时，产物片段为225 bp；若CCR5基因发生32碱基缺失时，产物片段为193 bp，当两个片段同时出现时即为杂合子(CCR5/CCR5Δ32)，见图1。样本中均无CCR5Δ32/CCR5Δ32纯合子出现。CCR5基因型及等位基因在两组研究对象中符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=1.76，P>0.05)，CCR5的基因频率在两组研究对象中显著高于CCR5Δ32。见表1。

2.3SLE患者CCR5/CCR5基因型组与CCR5/CCR5Δ32基因型组临床检测指标比较 将SLE组按基因型的不同分成CCR5/CCR5组与CCR5/CCR5Δ32组。两基因小组C3、C4、ANA滴度均无差异，CCR5/CCR5Δ32组发病年龄低于CCR5/CCR5组，但无显著差异。突变组抗dsDNA抗体阳性率高于野生组(P<0.05)。见表2。

M为marker，除2号为杂合子(CCR5/CCR5Δ32)外，其余均为野生型纯合子(CCR5/CCR5)

表1 两组CCR5基因多态性的差异〔n(%),n=500〕

表2 SLE患者CCR5/CCR5基因型组与CCR5/CCR5Δ32基因型组临床检测指标比较

3 讨 论

CCR5是CC类趋化因子受体，可结合RANTES、MIP-1α等结合参与炎症反应，介导SLE等自身免疫性疾病对各器官组织的攻击。CCR5Δ32是CCR5的突变株，缺失32个碱基使编码CCR5的基因功能丧失，而成为无效受体，从而无法完成炎症反应，是机体的一种自我保护机制〔17〕。全球统计数据表明，CCR5Δ32等位基因频率为4.18%，各个国家的数据有较大区别，欧洲其基因频率为5%～16%，而美洲、日本、中国的频率较低〔18〕。杨仕贵等〔15，19〕统计安徽省汉族人群CCR5Δ32等位基因频率为0.63%。

Schauren等〔15〕发现CCR5Δ32基因频率存在的差异不仅受人种影响外，还与SLE患者疾病进展程度、发病年龄相关，对巴西南部SLE女性患者检查发现，有CCR5Δ32基因存在的患者其发病年龄较未突变患者更早〔20〕，从而证实了这个观点。本实验CCR5Δ32突变组比未突变组的发病年龄较低，但没有统计学意义，不除外人种基因突变频率低的影响，也与患者纳入队列时的病情、样本量不够大等因素有关。

有研究发现，SLE发病年龄越早，损伤程度越大，受累器官越多，以肾脏损伤最为明显，且ANA及抗dsDNA抗体阳性率越高〔21〕。本研究结果可能由于CCR5Δ32的突变提高了ds-DNA抗体阳性率，而ds-DNA抗体阳性率的提高是否影响SLE的进展及受累器官，特别是肾脏损伤的严重程度，还需要进一步通过对肾脏相关检查与dsDNA抗体的联合分析来深入研究。

综上，辽宁老年人群中主要以CCR5野生基因型为主，CCR5Δ32突变频率较低。CCR5Δ32突变可以通过提高抗dsDNA抗体的阳性率来影响SLE。