海南省新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症发生情况及基因突变分析研究

赵振东，王洁

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症是一种G6PD基因突变引起的X连锁不完全显性遗传性溶血性酶缺陷疾病，该病是引起蚕豆病、感染性溶血、药物性溶血以及新生儿高胆红素血症等的重要原因，全球约4亿人口罹患此病[1]。目前已发现G6PD基因有400多个基因突变类型[2]，而我国已检出25种，且多分布在外显子区[3]。G6PD缺乏症在我国南方地区发病率高，尤以广东、广西以及海南地区发病率最高[4]。迄今为止未见海南省全省人群大规模G6PD基因调查分析，故本研究选取2017年出生的全海南省新生儿进行G6PD基因筛查，分析海南省新生儿G6PD基因突变类型及其分布特点，旨在为优生优育提供科学依据。

本研究价值：

（1）全球约4亿人口罹患葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症。据报道已发现400多个基因突变，而我国已报道25种突变类型，除IVS-5 636/637T del、IVS-5 C134T和IVS11 93T＞C（SNP）在内含子区外，余者分布在外显子区。虽然平素可无任何症状，如遇诱因可引发急性溶血性贫血而导致死亡，目前尚无有效的根治措施，该病在海南省高发，因此在海南省开展新生儿大规模的G6PD缺乏症筛查和基因诊断，做到早发现早预防显得尤为重要。

（2）赵振东等研究结果显示，海南省新生儿G6PD缺乏症发生率较高，且基因突变类型丰富，特别是海南省特有少数民族——黎族的G6PD缺乏症发生率显著高于汉族。同时，G6PD缺乏症基因突变类型以c.1376G＞T、c.1388G＞A、c.95A＞G 和 c.1024C＞T 为主；且发现 5例未知突变，其中 c.86C＞T、c.487G＞A和c.1004C＞A突变各有1例，属于海南省人群的首次报道。该结论有利于G6PD缺乏症的防治，为后续基因突变导致的不同临床表型研究奠定了分子基础。

本研究局限性：

受限于检测样本量以及相关经费等一些原因，目前只检测了2017年的样本，另外受限于患者意愿等因素还有2例未知突变未能抽血进行基因测序。另外限于熔解曲线法检测探针覆盖序列变异范围，本研究只报道了检测到16种中国人群常见变异位点中10种变异。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取全海南省内各助产单位2017-01-01至2017-12-31出生的活产新生儿130 512例，其中男71 531例，女58 981例。依据《新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症筛查与诊断实验室检测技术专家共识》[5]（简称：G6PD专家共识）指出的G6PD筛查要求，以出生满72 h并充分哺乳8次以上为纳入标准。采集符合纳入标准的新生儿的足跟血制成滤纸干血片，用于G6PD基因初筛。抽取初筛可疑样本2 ml静脉血于EDTA-K2抗凝管，用WHO推荐的G6PD/6-磷酸葡萄糖脱氢酶（6GPD）比值法进行生化检查确诊。生化检查确诊为G6PD缺乏症的患儿，找出其干血片进行基因分型。检验前进行样本的质量控制：（1）初筛干血片质量控制：水平晾干后密封于封口袋内，3 d内通过新生儿疾病筛查标本冷链物流服务项目运送至海南省新生儿筛查中心实验室立即检测，未能立即检测的样本于-20 ℃冷柜保存；（2）生化检查确诊抗凝血样本质量控制：定期召回初筛可疑病例，采集其静脉血置于EDTA-K2抗凝管中，摇匀，立即送检，当天进行检测。

本研究经海南省妇幼保健院伦理委员会批准〔海南省妇幼保健院（2018）伦审第（37）号〕，患儿家长均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 仪器 全自动荧光免疫分析仪（2021GSP）、自动打孔仪（2081Panthera-PuncherTM9）、日立7060生化仪、ABSON MicBio-IV型孵育振荡器、核酸提取仪（Lab-AidTM 824）及伯乐Bio-Rad CFX96型实时PCR扩增仪。

1.2.2 试剂 珀金埃尔默股份有限公司G6PD测定试剂盒、广州米基科技发展有限公司G6PD/6GPD试剂盒、厦门致善生物科技股份有限公司Lab-Aid核酸提取Micro试剂盒和G6PD荧光PCR熔解曲线法基因突变检测试剂盒（可检测中国人常见的16种G6PD基因突变类 型：c.1388G＞A、c.1376G＞T、c.383T＞C、c.95A＞G、c.1387C＞T、c.392G＞T、c.1360C＞T、c.487G＞A、c.517T＞C、c.592C＞T、c.871G＞A、c.1004C＞A、c.1024C＞T、c.1381G＞A、c.493A＞G、c.519C＞T）。

1.2.3 试验方法

1.2.3.1 G6PD基因筛查试验 严格按照试剂盒说明书进行操作，使用G6PD测定试剂盒，即GSP荧光分析法对新生儿干血片上GSP进行初筛。结果判读标准：测量值≤2.6 U/dl为G6PD基因初筛阳性。

1.2.3.2 G6PD生化检查确诊试验 严格按照试剂盒说明书操作，使用G6PD/6GPD试剂盒，即日立7060生化仪对召回可疑病例进行生化检查确诊。结果判读标准：G6PD/6GPD＜1为G6PD缺乏症。

1.2.3.3 G6PD基因突变检测 严格按照试剂盆说明书操作，找出确诊为G6PD缺乏症患儿的滤纸干血片，使用核酸提取仪Lab-Aid824提取干血片样本中基因组DNA。然后用带有FAM、HEX、ROX和Cy5检测通道且具有熔解曲线分析功能的Bio-Rad CFX96型实时PCR扩增仪进行基因扩增和熔解曲线分析。按照试剂盒说明书上的结果判读标准判断是否发生突变及突变类型。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析。计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2017年度海南省全省新生儿G6PD缺乏症初筛、确诊情况 2017年度海南省全省新生儿G6PD缺乏症初筛样本中初筛阳性率为4.00%（5 221/130 512），G6PD/6GPD确诊2 993例，经基因检测该2 993例新生儿均有G6PD基因突变。海南省新生儿G6PD/6GPD确诊G6PD缺乏症发生率和G6PD基因突变率均为2.29%（2 993/130 512）（见表1）。

G6PD/6GPD确诊G6PD缺乏症发生率汉族为1.80%（1 972/109 590）， 黎 族 为 5.28%（934/17 698），其他民族为2.70%（87/3 224）。黎族G6PD缺乏症发生率高于汉族，差异有统计学意义（χ2=826.206，P＜0.001）。

表1 2017年度海南省全省新生儿G6PD缺乏症初筛情况及G6PD/6GPD确诊人数Table 1 The first screening of neonatal G6PD deficiency and the number of G6PD/6GPD diagnosis in Hainan Province in 2017

2.2 2017年度海南省全省G6PD缺乏症新生儿基因突变类型 本次共检出10种基因突变类型：1 636例（54.66%）c.1376G＞T，659 例（22.02%）c.1388G＞A，254例（8.49%）c.95A＞G，204例（6.82%）c.1024C＞T，93 例（3.11%）c.871G＞A，64例（2.14%）c.519C＞T，25例（0.84%）c.392G＞T，22例（0.74%）c.1360C＞T，19例（0.63%）517T＞C，11例（0.37%）c.592C＞T，并检出8例（0.27%）c.1376G＞T复合c.1388G＞A突变，3例（0.10%）c.1376G＞T复 合 c.871G＞A突 变，3例（0.10%）c.1376G＞T复合c.517T＞C突变。并发现5例（0.17%）未知突变，目前有3例经基因测序发现1例为 487G＞A、1例为 1004C＞A 和 1例为 c.86C＞T，另 2例因家属和经费等原因未做测序检测。

3 讨论

G6PD缺乏症是多民族的遗传性疾病，是世界上最常见的酶缺乏症[6]，WHO将其划分为Ⅰ～Ⅴ共5个类别[7]，绝大多数缺陷个体属重度缺陷（Ⅱ和Ⅲ类），虽然平素可无任何症状[8]，但是由于G6PD缺乏，红细胞更容易受到食物和药物引起的氧化应激的损伤，导致急性溶血性贫血[9]，若不能制止溶血和及时输血，可发生死亡[10]。目前G6PD缺乏症尚无有效的根治措施，但该病在中国热带、亚热带地区较为普遍，特别是海南省属该病的高发地区[11]。因此在海南省新生儿期开展大规模的筛查和基因诊断，做到早发现早预防显得尤为重要。

目前临床上使用的G6PD基因检测方法有等位基因特异性扩增、PCR-反向斑点杂交技术及基因测序技术、等位基因寡核苷酸探针杂交等[12]，但是以上方法受到操作高要求、试剂成本、仪器设备等因素的限制，而多色探针荧光PCR熔解曲线法是近年来兴起的一种G6PD基因检测手段，是2019年新发布的G6PD专家共识[5]推荐的基因检测方法，该方法涵盖了98.5%的中国人群常见的10种基因突变类型，又包含了6种较为少见的基因突变类型，在判断基因位点突变的同时，因其标记不同颜色的生物素探针，可直接在PCR仪上分析结果，且试剂成本低、灵敏度高、特异性强[13]，已逐渐应用于临床检测当中，这也是本研究选用此方法的原因所在。

本研究统计分析发现，2017年度海南省全省新生儿G6PD基因突变以占54.66%的c.1376G＞T和占22.02%的c.1388G＞A为主，两者合占总突变的76.68%，其余基因型均不足10%，这是中国人群最常见的G6PD基因突变基因型[14]。并且c.95A＞G和c.1024C＞T分别占总突变类型的8.49%、6.82%，说明这两种也较为常见。2017年度海南省出生的新生儿可以视为海南省人口的代表，以上4种基因突变占总突变的91.99%，可以认为这是海南省人群G6PD基因突变的主要类别。本次共检出10种基因突变类型，相较于其他研究[15-16]G6PD基因突变类型丰富。G6PD/6GPD确诊的2 993例G6PD缺乏症新生儿经基因检测均有突变，海南省人群G6PD基因突变率约为2.29%，汉族为1.80%，黎族为5.28%，其他民族为2.70%。汉族和黎族G6PD基因突变有差异，黎族人群G6PD缺乏症发生率显著高于汉族，差异具有统计学意义，这说明了G6PD基因突变不但具有地域差异而且也有种族特点[17-18]。笔者认为海南省人群G6PD基因突变率会更高，原因如下：首先G6PD/6GPD对于女性杂合子的低检出率，必然会造成女性杂合子的漏检。另外地中海贫血患者会影响G6PD 活性增高已达成共识[19-20]，这必然使得GSP荧光分析法对新生儿G6PD的初筛受到影响，造成部分G6PD杂合子的漏检，这也直接影响G6PD基因突变的检出率。而海南省恰恰是地中海贫血高发地区，特别是黎族发病率更高[21]，由此推算海南省黎族新生儿G6PD基因突变率会高于本次得到的5.28%。G6PD基因全长20 kb，共编码515个氨基酸[22]，从而导致突变的复杂性。本研究发现3种复合突变也证实了这一点：8例c.1376G＞T复合c.1388G＞A；3例c.1376G＞T复合c.871G＞A突变；3例c.1376G＞T复合c.517T＞C突变。PCR熔解曲线法可以检测探针覆盖区域的序列变异，因此本研究先后检出了5例未知位点突变，其中3例经基因测序发现c.86C＞T、c.487G＞A和c.1004C＞A突变各有1例，各占总突变的0.03%，这3例基因突变类型在海南还未见报道。另外2例未知突变，限于家属和经费等原因还未做测序。

综上所述，海南省新生儿G6PD缺乏症发生率较高，且基因突变类型丰富，特别是海南省特有少数民族——黎族的G6PD缺乏症发生率显著高于汉族。同时，G6PD缺乏症基因突变类型主要以c.1376G＞T、c.1388G＞A、c.95A＞G和c.1024C＞T为主；且发现5例未知突变，其中c.86C＞T、c.487G＞A和c.1004C＞A突变各有1例，属于海南省人群的首次报道。该结论有利于G6PD缺乏症的防治，为后续基因突变导致的不同临床表型研究奠定分子基础。

作者贡献：赵振东进行文章的构思与设计、数据收集与整理、统计学处理、论文修订，对文章整体负责、监督管理；赵振东、王洁进行研究的实施与可行性分析、结果分析与解释，撰写论文；王洁负责文章的质量控制及审校。

本文无利益冲突。