响应面法优化牛樟芝高产总三萜发酵培养基

王锐丽，段鸿斌，李尽哲，殷东林

（信阳农林学院生物与制药工程学院，河南信阳464000）

牛樟芝简称“樟芝”，学名为Antrodia camphorata，俗名牛樟菇、红樟芝、血灵芝等，属于多孔菌科、多孔菌属的珍稀药用真菌[1]。由于牛樟芝对寄生主很挑剔，且属于多年生植物，数量稀少，采集不易，价值远远凌驾于灵芝、冬虫夏草、人参等名贵中药材之上，被称之为“森林中的红宝石”[2]。至2012 年从牛樟芝中已分离得到225 种生理活性成分，如多糖、萜类化合物（单萜、二萜、羊毛甾烷型三萜、麦角甾烷型三萜、甾体等）、免疫蛋白、维生素、微量元素锗、腺苷、凝集素、马来酸、琥珀酸衍生物、血压稳定物质等[3]，其中菌体中三萜类化合物种类就达几十种。这些生理活性成分具有抗氧化、抗肿瘤、保肝、解毒、解酒、抗肝、消炎、抗过敏、降“三高”等重要功效[4-7]，可广泛应用于医药、食品、化妆品、饲料、日化等领域。

由于牛樟芝生长环境的特殊性，生长周期长，野生资源枯竭，故其大规模的开发应用受到了极大的限制。目前，对于牛樟芝人工培育的研究多集中在利用正交试验或响应面法优化牛樟芝液体发酵条件[8]，及以樟芝胞外多糖和胞内多糖为目的产物，探索樟芝液体发酵的培养基配方组成[9]。牛樟芝人工培育技术大致可以分为液体发酵法、固体培养法、椴木栽培法3 种[10]。通过液态发酵可以在短时间内大量获得牛樟芝菌丝体，是最有效的大规模人工培养方式，这种方法生产效率高、稳定，也比较容易推广。针对牛樟芝液态发酵的研究集中在提高菌体量、多糖产量方面，同时对多糖提取工艺、药理活性等也有研究[11-13]。经研究发现，菌株不同，其生物量、多糖和三萜的产量相差比较大，说明菌株和培养条件对樟芝代谢产物的生产量影响较大[14-15]。

本项目以牛樟芝为研究对象，采用筛选试验（Plackett-Burman，PB）[16]和中心组合设计（central composite design，CCD）试验[17]对其高产三萜类化合物培养基进行优化，以期获得生产三萜类化合物的最佳培养基配方，为进一步大规模的牛樟芝深层发酵培养提供指导作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

牛樟芝（Antrodia camphorata）信阳农林学院生物与制药工程学院微生物实验室保藏。

1.1.2 培养基

斜面培养基（PDA 培养基）：200 g/L 马铃薯，20 g/L葡萄糖，15 g/L 琼脂，pH 自然。

种子液培养基：200 g/L 马铃薯，20 g/L 葡萄糖，5 g/L蛋白胨，1 g/L MgSO4，2 g/L KH2PO4，50 mg/L VB1。

基本发酵培养基：20 g/L 葡萄糖，10 g/L 大豆粉，10 g/L 玉米粉，5 g/L 酵母粉，5 g/L 牛肉膏，10 g/L 黄豆粉，5 g/L 蛋白胨，1 g/L MgSO4，2 g/L KH2PO4，50 mg/L VB1。

1.2 方法

1.2.1 培养条件

采用二级发酵法获得菌丝体[18]。将活化的斜面菌种接入种子液培养基中，28 ℃、200 r/min 培养4 d 后，再以10%接种量接入装有基本发酵培养基或优化发酵培养基的摇瓶中，28 ℃、200 r/min 培养 10 d。用 6 层纱布减压过滤收集菌丝体，用蒸馏水冲洗3 次，于55 ℃烘干至恒重。

1.2.2 三萜化合物含量测定

以齐墩果酸为标准物，用香草醛-高氯酸法在550 nm 波长下绘制标准曲线。牛樟芝菌丝体中总三萜化合物提取和含量测定参照文献[19]进行。

1.2.3 PB 试验分析

选用 N=12 的 Plackett-Burman（PB）试验设计考察基本发酵培养基的8 个组分对总三萜含量的影响，PB试验设计的因素和水平如表1，其他3 个组分的浓度不变。设3 次重复试验，平行试验3 组，数据采用平均值±标准差表示。应用Design Expert 8.0.6（Stat-Ease Inc，Minneapolis，USA）软件进行数据分析，筛选出对牛樟芝菌丝体产三萜影响显著的主要因素。

表1 PB 试验因素与水平设计Table 1 Factors and levels for Plackett-Burman（PB）design

1.2.4 最陡爬坡试验

对PB 试验筛选出的主要因素进行最陡爬坡试验，能最大限度逼近各因素的最大响应区域。

1.2.5 响应面分析法

根据CCD 的中心组合试验设计原理，进行三因素三水平的响应面分析试验，使用Design Expert 8.0.6 软件对试验数据进行二次回归拟合，模型建立及方差分析。

1.2.6 拟合度试验

进行拟合度试验，主要因素采用响应面预测的最佳浓度，分析真实值和预测值之间的拟合度，验证所建回归模型的适用性和可靠性。数据分析通过Excel 2010 处理，统计学分析通过DPS 7.05 软件处理，利用Design-expert 8.0.6 软件进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 PB试验结果及分析

PB 试验设计及试验结果见表2，获得的三萜含量为（6.86±0.17～13.54±0.34）mg/g。采用基本发酵培养基培养的牛樟芝菌丝体中三萜含量为（12.29±0.43）mg/g。使用Design Expert 8.0.6 对表2 的试验数据进行拟合，其因素奉献率及方差分析结果如表3。该模型P 值为0.015 4，达到显著水平，说明模型拟合良好。校正决定系数Radj2为0.933 9，说明有93.39%的试验数据的变异性可用该模型进行解释。

玉米粉（X3）和黄豆粉（X6）对三萜总含量的影响极显著（P＜0.01），牛肉膏（X5）对三萜总含量的影响显著（P＜0.05）。因此把 X3、X5、X63 个因素视为影响牛樟芝菌丝体三萜含量的主要因素。由表3 可知在显著因素中，因素X3和X5的回归系数为负数，说明它们对三萜总含量的影响为负效应，在最陡爬坡试验中应降低其添加量，因素X6的系数为正值，后续应提高其添加量。依据表3 贡献率及相关系数的大小分析，后续试验不再添加次要因素酵母粉和蛋白胨，葡萄糖及大豆粉浓度分别确定为20、10 g/L。

表2 PB 试验设计及试验结果Table 2 Design of PB test and corresponding results

2.2 最陡爬坡试验结果

对玉米粉（X3）、牛肉膏（X5）和黄豆粉（X6）3 个显著因素进行最陡爬坡试验，X3、X5、X6的步长分别为 6、1、5 g/L，步长的计算方法参照[20]，具体试验编码及结果如表4。

表4 最陡爬坡试验的设计及结果Table 4 Steepest ascent design and results

由表4 可知，三萜化合物总含量在第4 组试验中达到最高，因此以该组对应的玉米粉含量（18 g/L）、牛肉膏（4.5 g/L）和黄豆粉（30 g/L）作为后续响应面试验的中心点。

2.3 响应面优化试验结果及分析

2.3.1 中心组合设计及结果

采用CCD 试验设计对影响牛樟芝菌丝体产三萜化合物的3 个显著因素：玉米粉含量（X3）、牛肉膏含量（X5）和黄豆粉含量（X6）进行三因素三水平的响应面分析试验，以产生的三萜含量（Y）为响应值，选择6 个中心点试验组以估计误差，星号臂长（γ）值为1.682，CCD试验设计及结果见表5。

表5 中心组合试验设计及结果Table 5 Central composite design and results

2.3.2 回归模型的建立及方差分析结果

应用Design Expert 8.0.6 对表5 的试验数据进行拟合，得到二次多项回归模型如下响应面二项模型的方差分析见表6。

表6 响应面二项模型的方差分析Table 6 ANOVA table for response surface quadratic model

续表6 响应面二项模型的方差分析Continue table 6 ANOVA table for response surface quadratic model

由表6 的方差分析结果可知，回归模型P＜0.000 1，达到极显著水平；失拟项P=0.249 6，不显著；决定系数R2=0.962 9，表明该模型拟合度良好；校正决定系数=0.929 6，表明大约有93%的响应值（Y）变化可以用该模型进行解释。一次项X3、X6，二次项和对模型影响极显著，交互项X3X6影响显著，其余项影响不显著。

2.3.3 响应面分析与优化

分别将玉米粉（X3）、牛肉膏（X5）和黄豆粉（X6）中的一个因子固定在中心点水平（0 水平），直观分析另外两个因素及其交互作用对响应值影响效果的大小，其回归模型的等高线及其响应面如图1～图3 所示。

图1 玉米粉和牛肉膏交互影响三萜含量的响应面和等高线Fig.1 Response surface plots（left）and contour line（right）of effects of interactions between corn flour and beef extract on the triterpenoid content

图2 玉米粉和黄豆粉交互影响三萜含量的响应面和等高线Fig.2 Response surface plots（left）and contour line（right）of effects of interactions between corn flour and soybean meal on the triterpenoid content

图3 牛肉膏和黄豆粉交互影响三萜含量的响应面和等高线Fig.3 Response surface plots（left）and contour line（right）of effects of interactions between beef extract and soybean meal on the triterpenoid content

图2 的等高线密集，呈椭圆形，说明X3和X6的交互作用显著。由图1 和图3 可知X3和X5及X5和X6的交互作用不显著。

应用Design Expert 8.0.6 软件对所建模型进行参数优化分析，玉米粉浓度为16.07 g/L，牛肉膏为4.5 g/L，黄豆粉为31.93 g/L，此时最大响应值为15.46 mg/g。最终确定优化后培养基配方为：20 g/L 葡萄糖，10 g/L 大豆粉，16.07 g/L 玉米粉，4.5 g/L 牛肉膏，31.93 g/L 黄豆粉，1 g/L MgSO4，2 g/L KH2PO4，50 mg/L VB1。

2.4 拟合度验证

用优化的培养基配方进行牛樟芝发酵培养，取3次重复试验的平均值，牛樟芝菌丝体三萜化合物含量为（15.40±0.15）mg/g，与模型预测值 15.46 mg/g 非常接近，与预测值拟合度良好，说明上述模型能较好地预测菌丝体实际生产的三萜含量。

3 结论

本研究对牛樟芝菌丝体发酵产总三萜类化合物的培养基进行优化，通过PB 法筛选出玉米粉、牛肉膏、黄豆粉为影响总三萜含量的3 个主要因素。根据CCD 中心组合试验及三因素三水平的响应面分析，优化得到菌丝体高产三萜的最佳培养基：20 g/L 葡萄糖，10 g/L 大豆粉，16.07 g/L 玉米粉，4.5 g/L 牛肉膏，31.93 g/L 黄豆粉，1 g/L MgSO4，2 g/L KH2PO4，50 mg/L VB1。采用基本发酵培养基培养牛樟芝其菌丝体中总三萜含量为（12.29±0.43）mg/g，经培养基优化处理后三萜类含量为（15.40±0.15）mg/g，相比初始其产量提高了25.3%。说明响应面法可用来优化牛樟芝菌丝体高产三萜类化合物的培养基配方，为进一步大规模的牛樟芝深层发酵培养具有一定的参考价值。