普洱市不同产茶区普洱生茶香气成分差异性分析

张晨霞，王国成，王超，李清，刘顺航，毕开顺，*

（1.沈阳药科大学，辽宁沈阳110016；2.天士力控股集团有限公司研究院，天津300410；3.云南天士力帝泊洱生物茶集团有限公司，云南普洱665000）

普洱茶[Camellia sinensis（Linn）var.assamica（Mast.）Kitamura]是我国云南省特有的历史名茶，也是典型的地理标志产品[1]。普洱茶是以地理标志保护范围内的云南大叶种晒青毛茶为原料加工制成，具有独特品质特征的茶叶。按其加工工艺及品质特征，普洱茶可分为普洱生茶和普洱熟茶[2-3]。

普洱生茶是以晒青茶经蒸压成型、干燥、包装等工艺加工而成，可以直接饮用，又可以通过贮藏过程中自然发酵转化为普洱陈茶，贮藏过程对普洱生茶影响较大，研究表明贮藏时间越长，茶品质越好，尤其是对普洱生茶品质中的香气成分影响最为显著[4-5]。而不经贮藏的普洱生茶与普洱晒青茶品质相似，其主要香气成分为醇类、碳氢类和酮类化合物[6]。同时，有研究指出，普洱茶的主要香气成分会因产地、同一产地不同产茶区而存在很大的差异[7-8]。目前，不同地区普洱茶差异性研究较多，同一地区不同产茶区普洱茶香气成分的差异性的相关报道较少，值得进一步的研究。

固相微萃取 （headspace solid-phase microextraction，SPME）技术是一种新型的无溶剂样品预处理技术，该技术集取样、萃取、浓缩和进样为一体，具有操作简单、样品量少、无溶剂、萃取样品后可直接与气相色谱（gas chromatography，GC）、气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 联用进行进样分析等优点[9-10]。目前，SPME 技术现已广泛应用于食品[11-13]、药品[14]、环境[15]等领域样品的分析。本研究采用顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）结合 GC-MS 对普洱市 5 个产茶区（思茅区、景东、景谷、景迈山、镇沅）普洱生茶样品进行香气成分的分析和比较，揭示不同产茶区普洱生茶香气成分的差异，以期为普洱市不同产茶区普洱生茶的产区判别和香气品质的提升提供一定的理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茶样品：思茅区（SM）7 个、景东产茶区（JD）8 个、景迈山产茶区（JM）12 个、景谷产茶区（JG）8 个、镇沅产茶区（ZY）7 个：2010～2012 年制作普洱生茶，云南天士力帝泊洱生物茶集团有限公司提供，茶叶样品使用前经粉碎机粉碎，并通过2.0 mm 圆孔筛；氯化钠（分析纯）：天津市化学试剂一厂，使用前 120 ℃烘 2 h；C8～C32正构烷烃混标（500 mg/L，溶于氯仿中）：美国AccuS－tandard 公司。

1.2 仪器与设备

Trace1300-ISQ 气相色谱-质谱联用仪：美国Thermo Fisher Scientific 公司；HP-5MS 石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）：美国 Agilent 公司；65 μm PDMS/DVB 萃取头、固相微萃取装置、手动进样手柄：美国Supelco 公司；IT-09A 型恒温磁力搅拌器：上海一恒科学仪器有限公司；ME-T 分析天平：梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 顶空固相微萃取方法

称取粉碎普洱生茶粉2.0 g 放置于20 mL 顶空瓶中，加入2.0 g NaCl，放入转子，加入6 mL 煮沸超纯水，立即采用聚四氟乙烯封口，将顶空瓶放置于磁力搅拌器上的水浴中，在（60±2）℃、300 r/min 条件下平衡10 min，然后将65 μm PDMS/DVB 萃取头插入顶空瓶中，推出吸附头，（60±2）℃恒温下吸附 60 min，吸附结束后拔出萃取头立即插入到气相色谱（GC）进样口，250 ℃解吸附4.0 min，同时启动GC-MS 进行数据采集。

1.3.2 仪器条件

GC 条件：色谱柱为HP-5MS 石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样方式为手动进样；升温程序：初始温度 50 ℃，以 2 ℃/min 升温至 130 ℃，保持 2 min，然后以10 ℃/min 升温至280 ℃，保持3 min，总运行时间为60 min；载气：高纯氦气，纯度≥99.999%；载气流速0.8 mL/min；进样口温度250 ℃；进样模式为无分流进样。

MS 条件：离子源为EI 源，电子能量70 eV；接口温度为280 ℃；离子源温度为230 ℃；四极杆温度为150 ℃；发射电流为34.6 A；扫描方式：全扫描；质量扫描范围：35 aum～350 aum；溶剂延迟时间：3 min。

1.3.3 保留指数测定

取C8～C32混标稀释液，将1.3.2 中进样方式改为自动进样、进样量 1 μL、分流比为 10 ∶1，其余条件不变，进行正构烷烃的分析。根据C8～C32每个烷烃的出峰时间和所要计算化合物的出峰时间，采用下式计算各挥发性组分的保留指数（retention index，RI）：

式中：tx、tn和tn+1分别为被分析组分和碳原子数处于 n、n+1 之间的烷烃（tn＜tx＜tn+1）流出峰保留时间，min。

1.4 数据处理

采用Trace1300-ISQGC-MS 自带谱库（NIST 11）检索定性分析，同时将每种化合物计算所得保留指数与文献已报道的采用相同色谱柱所得保留指数进行对比，并综合NIST 谱库相似度、RI 一致度高的化学结构为最优鉴定结果，文献查询不到保留指数的化合物以NIST 数据库相似度为判定标准。试验结果采用峰面积归一法进行定量，以各组分峰面积与色谱图总峰面积之比值表示其相对含量。不同产茶区普洱生茶样品中香气成分差异采用Duncan's multiple range test 分析，分析采用SPSS 17.0 软件；偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）采用SIMCA-P 12 软件。

2 结果与分析

2.1 不同产茶区普洱生茶香气组成分析

采用 65 μm PDMS/DVB 结合 GC-MS 分别对普洱市5 个产茶区的普洱生茶香气组分进行分析，每个产茶区普洱生茶代表性香气成分总离子流图如图1 所示，香气定性和定量结果如表1 所示。

图1 不同产茶区普洱生茶代表性香气总离子流图Fig.1 Total ion current diagram of representative arome of raw Pu-erh tea samples of different producing areas

表1 普洱市不同产茶区普洱生茶中香气化合物Table 1 Aroma compounds in raw Pu-erh tea samples of different producing areas of Pu'er city

续表1 普洱市不同产茶区普洱生茶中香气化合物Continue table 1 Aroma compounds in raw Pu-erh tea samples of different producing areas of Pu'er city

在普洱市5 个产茶区42 个普洱生茶样品中共检测出83 种物质，其中醇类化合物23 种，碳氢类化合物20 种，酯类化合物12 种，甲氧基苯类化合物8 种，酮类化合物8 种，酸类化合物4 种，酚类化合物3 种，醛类化合物3 种，含氮类化合物2 种。景东产茶区8 个普洱生茶样品共检测出74 种化合物，其中醇类化合物相对百分含量最高，达到了（52.109±4.126）%，其次相对百分含量较高的分别为酮类化合物（12.274±2.963）%、甲氧基苯类化合物（8.655±2.729）%、酯类化合物（8.580±1.910）%和碳氢类化合物（7.725±2.898）%，含氮类化合物（2.358±1.149）%、醛类化合物（1.934±1.101）%、酚类化合物（1.202±0.844）%和酸类化合物（0.992±0.861）%相对百分含量较低；镇沅产茶区7 个普洱生茶样品共检测出62 种化合物，其中醇类化合物相对百分含量最高，达到了（50.666±4.394）%，其次相对百分含量较高的分别为酮类化合物（15.013 ±1.883）%、碳氢类化合物（9.499±3.869）%、酯类化合物（9.078 ± 1.564）%和甲氧基苯类化合 （5.463 ±1.163）%，含氮类化合物（2.351±0.417）%、醛类化合物（1.432±0.425）%、酚类化合物（1.257±0.663）%和酸类化合物（0.803±0.282）%相对百分含量较低；景迈山产茶区12 个普洱生茶样品共检测出68 种化合物，其中醇类化合物相对百分含量最高，达到了（53.509±4.683）%，其次相对百分含量较高的分别为酮类化合物（15.711±3.324）%、碳氢类化合物（10.038±3.098）%和酯类化合物（8.595±1.822）%，甲氧基苯类化合（2.995±1.483）%、含氮类化合物（1.855±0.673）%、醛类化合物（1.435±0.531）%、酚类化合物（1.297±0.574）%和酸类化合物（0.721±0.282）%相对百分含量较低；思茅区7 个普洱生茶样品共检测出63 种化合物，其中醇类化合物相对百分含量最高，达到了（54.776±10.854）%，其次相对百分含量较高的分别为酮类化合物（14.523±4.215）%、碳氢类化合物（9.311±2.421）%、含氮类化合物（8.230±4.703）%和酯类化合物（5.163±1.278）%，醛类化合物（1.212±0.544）%、酚类化合物（0.946±0.648）%、甲氧基苯类化（0.652±0.641）%、酸类化合物（0.383±0.401）%相对百分含量较低；景谷产茶区8 个普洱生茶样品共检测出60 种化合物，其中醇类化合物相对百分含量最高，达到了（48.266±7.880）%，其次相对百分含量较高的分别为酮类化合物（21.937±4.666）%、碳氢类化合物（10.444±4.486）%、和酯类化合物（6.607±1.710）%，含氮类化合物（3.466±2.266）%、酚类化合物（1.847±0.523）%、醛类化合物（1.747±0.896）%、甲氧基苯类化（0.641±1.129）%、酸类化合物（0.078±0.151）%相对百分含量较低。

通过分析可见，普洱生茶的香气组成中醇类、酮类、碳氢类和酯类化合物含量均较高，醇类化合物大多具备的花果香，其中一些醇类化合物还伴有木香（芳樟醇、芳樟醇氧化物、萜品醇、雪松醇等）对普洱生茶香气具有较好的协调性[16]；酮类、酯类化合物大多也具备花果香，其中酮类化合物中β-紫罗兰酮也伴有特殊的木香[17]；碳氢类化合物中的饱和烃对茶香气贡献较小，不饱和烃对茶香气贡献较大[18]；甲氧基苯类化合物是普洱生茶贮藏过程中自然陈化产生，是普洱茶陈香风味的主要贡献者[19-20]。

2.2 不同产茶区普洱生茶香气成分差异性分析

2.2.1 差异显著性分析

为了考察不同产茶区普洱生茶香气成分的差异，试验采用Duncan’s multiple range test 进行多组样本间差异显著性分析，结果如表1 所示，不同产茶区普洱生茶中醇类、碳氢类和醛类化合物相对百分含量差异不显著（P＞0.05）；景东、镇沅和景迈山3 个产茶区普洱生茶中酯类化合物差异不显著（P＞0.05），思茅区和景谷产茶区普洱生茶中酯类化合物差异也不显著（P＞0.05），景东、镇沅和景迈山产茶区普洱生茶中酯类化合物与思茅区、景谷产茶区普洱生茶中酯类化合物差异显著（P＜0.05）；景东、镇沅、景迈山和思茅区 4 个产茶区普洱生茶中酮类化合物差异不显著（P＞0.05），均与景谷产茶区普洱生茶中酮类化合物存在显著差异（P＜0.05）；景东、镇沅、景迈山和思茅区 4 个产茶区普洱生茶中酚类化合物差异不显著（P＞0.05），景东、镇沅、景迈山和景谷4 个产茶区普洱生茶中酚类化合物差异不显著（P＞0.05），思茅区和景谷产茶区普洱生茶中酚类化合物差异显著（P＜0.05）；景东、镇沅、景迈山和景谷4 个产茶区普洱生茶中含氮类化合物差异不显著（P＞0.05），均与思茅区普洱生茶中含氮类化合物存在显著差异（P＜0.05）；景东产茶区分别与思茅区、景谷产茶区普洱生茶中酸类化合物差异显著（P＜0.05），镇沅、景迈山与景谷产茶区普洱生茶中酸类化合物差异显著（P＜0.05）；对于甲氧基苯类化合物，仅有思茅区和景谷产茶区普洱生茶中的含量差异不显著（P＞0.05），其余产茶区普洱生茶中含量之间差异均显著（P＜0.05），甲氧基苯类化合物是普洱生茶贮藏过程中自然陈化产生，不同产茶区样品之间差异显著可能是因为原料其他组分差异所致。

2.2.2 PLS-DA 分析

以普洱市不同产茶区的42 个普洱生茶中所检测到的香气成分相对百分含量为变量进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA），建立PLS-DA 模型对普洱市不同产茶区普洱生茶样品进行区分和差异研究，结果如图2 所示。

图2 普洱市不同产茶区42 个普洱生茶样品PLS-DA 分析得分散点图Fig.2 PLS-DA score scatter plot of 42 raw Pu-erh tea samples of different producing areas of Pu'er city

不同产茶区的普洱生茶样品呈现明显的分离趋势，景迈山与镇沅产茶区普洱生茶样品差异性相对较小，与思茅区普洱生茶样品差异较大。根据不同产茶区普洱生茶样品离散度来看，思茅区和景东产茶区普洱生茶样品间离散度较大，说明样品间差异稍大，景迈山和镇沅产茶区普洱生茶样品间离散度相对较小，说明样品间差异相对较小。为了进一步探究对不同产茶区普洱生茶区分起重要作用的香气成分，试验采用42 个普洱生茶样品中所检测到的香气成分进行PLSDA 变量重要性因子（VIP）分布分析，VIP 值可以量化PLS-DA 分析中的每个变量对分类的贡献度[21]，VIP 值越大，变量在不同产茶区普洱生茶之间的差异越显著，相应结果见表2。

变量重要性因子分布分析结果显示，共有33 种香气成分对不同产茶区普洱生茶样品区分起主要作用（VIP ＞ 1），其中 4-乙基-1，2-二甲氧基苯（VIP =1.962）、3，4-二甲氧基甲苯（VIP=1.954）、1，2，3-三甲氧基-5-甲基苯（VIP=1.873）、1，2，3-三甲氧基苯（VIP=1.691）、乙酸香叶酯（VIP=1.582）、香叶基丙酮（VIP=1.519）、咖啡碱（VIP = 1.499）、β-紫罗兰酮（VIP =1.489）、Z-2-辛烯-1-醇（VIP = 1.458）、棕榈酸甲酯（VIP=1.456）、1-辛烯-3-醇（VIP = 1.361）、二氢猕猴桃内酯（VIP=1.358）、苯乙醇（VIP=1.357）、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（VIP=1.314）、α-紫穗槐烯（VIP=1.313），起主要作用的主要为甲氧基苯类、酮类、酯类和醇类物质，其中甲氧基苯类物质对区分不同产茶区普洱生茶贡献度最大，这可能是因为不同产茶区茶叶原料差异导致普洱生茶储藏过程中甲氧基苯类化合物生成物质、生成量的不同，其主要机理有待于深入研究。

表2 变量重要性因子（VIP）值大于1.0 的香气化合物Table 2 Aroma compound list with VIP value larger than 1.0

3 结论

本研究采用HS-SPME 结合GC-MS 分别对普洱市5 个产茶区的普洱生茶香气组分进行分析，42 个普洱生茶样品中共检测出83 种香气成分，香气组分以醇类化合物为主，其次为碳氢类、酯类、甲氧基苯类和酮类化合物。其中不同产茶区普洱生茶中醇类、碳氢类和醛类化合物相对百分含量差异均不显著（P＞0.05），甲氧基苯类化合物含量差异显著性（P＜0.05）比例较大，酯类、酮类、酚类、酸类和含氮类化合物含量差异显著性比例较小。以83 种香气组分相对百分含量为变量进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA），不同产茶区的普洱生茶样品呈现明显的分离趋势，变量重要性因子（VIP）分析，33 种香气成分对不同产茶区普洱生茶样品区分起主要作用（VIP ＞1），33 种香气成分中甲氧基苯类、酮类、酯类和醇类物质占比最大。本研究可为普洱市不同产茶区普洱生茶香气差异及贮藏过程中香气形成规律的深入研究提供理论支撑。