LV-ERK1-RNAi转染人非小细胞肺癌细胞的ERK1/2、DNA甲基转移酶1表达观察

张恒，孙宇，刘俊，陈尚威，周华富

1广西医科大学第一附属医院，南宁 530021；2广西医科大学第二附属医院

非小细胞肺癌(NSCLC)是多基因表达调控失衡共同作用得结果，由癌基因激活和抑癌基因失活引起分子方面的变异来启动[1]，而抑癌基因异常甲基化是其发展的重要因素。DNA甲基转移酶(DNMTs)参与肿瘤发生发展，正是通过调节肿瘤细胞内甲基化实现的[2]，其中DNMT1是催化基因甲基化的关键酶。我们的前期实验显示，NSCLC组织细胞抑癌基因启动子区甲基化水平与DNMT1表达呈正相关性[3]。RNAi技术因其快速、高效、易于操作等优点，在基因功能分析及基因治疗等众多领域广泛应用。丝裂原活化蛋白细胞外信号调节激酶MAPK/ERK通路调节多种生物学行为，其在真核生物中广泛保守，并且在许多细胞程序如细胞增殖，细胞分化，细胞运动和细胞死亡中起重要作用，是迄今发现的一种较重要的生长信号调节蛋白。近年研究显示，ERK1/2通路依据细胞类型以及不同的细胞环境中激活的基因决定，促进或抑制细胞增殖[4]。研究[5]表明，ERK激酶(MEK)/ERK信号通路的甲基化参与了癌症的发生发展。进一步研究表明，ERK激活缺陷可导致DNMT1下调[6]，此外包括E2F1和SP1在内的多种转录因子通过激活的MEK/ERK途径介导DNMT1的转录激活，鉴定了激活的MEK/ERK信号通路可作为DNMT1在癌症中调控和异常过表达的驱动力[7]。2019年2～5月，我们选取NCI-H1299细胞，以细胞外信号调节激酶1基因RNA干扰慢病毒载体(LV-ERK1-RNAi)转染，并观察细胞外信号调节激酶1(ERK1)、ERK2、DNA甲基转移酶1(DNMT1)mRNA及ERK1、磷酸化ERK1(p-ERK1)、DNMT1蛋白表达情况。

1 材料与方法

1.1 细胞、病毒及主要试剂 人NSCLC细胞(NCI-H1299)。LV-ERK1-RNAi(55281-1)、对照病毒(CON077)(上海吉凯公司)。1640培养基(吉凯基因公司)；胎牛血清(Ausbian公司)；DMEM(Corning公司)；胰酶(上海生工)；Puromycin(Clontech公司)；D-Hanks(吉凯基因公司)；TRIzol(上海普飞)；M-MLV(Promega公司)；SYBR Master Mixture(TaKaRa公司)；引物(上海吉凯基因公司)；兔源性一抗ERK1及鼠源性一抗p-ERK1、DNMT1(Abcam公司)，GAPDH、二抗(Santa Cruz公司)。

1.2 细胞培养、分组、LV-ERK1-RNAi转染及转染效率观察 从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入37 ℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻；完全解冻后，以1 300 r/min速度离心3 min，75%酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜；吸去冻存液上清，加入1 mL新鲜的完全培养基重悬细胞，将其培养于含10%胎牛血清的1640+10%FBS完全培养基中，放置在37 ℃、5%CO2培养箱中。24 h后更换1次培养液继续培养，保持细胞良好的生长状态。将NCI-H1299细胞随机分为3组，KD组和NC组按照慢病毒转染细胞操作说明分别转染LV-ERK1-RNAi、阴性对照病毒，CON组不作处理。参照预实验确定的MOI=10，加入最适病毒量转染16 h更换培养基继续培养，转染72 h后采用荧光显微镜观察细胞转染效率，转染效率=(荧光视野下细胞数/普通光视野下细胞数)×100%。空白对照组细胞未见绿色荧光蛋白表达，阴性对照病毒组、LV-ERK1-RNAi组均见绿色荧光蛋白表达，且转染72h后平均转染效率达80%以上。

1.3 各组NCI-H1299细胞ERK1/2、DNMT1 mRNA检测 转染后72 h采用real time PCR法检测。以TRIzol试剂提取RNA，Nanodrop 2000/2000C分光光度计分析测定所抽提RNA 的浓度及质量。逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA。SYBR Master Mixture试剂盒和 real time PCR仪器进行分析。扩增条件：95 ℃变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火和延伸30 s，共40个循环。CAPDH：5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′；ERK1：5′-ATGTCATCGGCATCCGAGAC-3′，5′-GGATCTGGTAGAGGAAGTAGCA-3′；ERK2：5′-TTACGACCCGAGTGACGA-3′，5′-CTGTATCCTGGCTGGAATCT-3′；DNMT1：5′-GGACAGG-GGACCCACGAAAG-3′，5′-CACACCTCACAGACGCCACAT-3′。采用相对定量分析F=2-ΔΔCt分析基因相对表达差异，ΔCt=目的基因Ct值-内参基因Ct值；-ΔΔCt=NC组ΔCt平均值-各样品ΔCt值；2-ΔΔCt反映各样品相对NC组样品目的基因的相对表达水平。

1.4 各组NCI-H1299细胞ERK1、p-ERK1、DNMT1蛋白检测 转染后72 h采用Western blotting法。接收细胞样品，PBS洗涤两次，加入裂解液；冰上裂解10～15 min后超声破碎细胞，4 ℃、12 000 g，离心15 min；取上清，BCA法测定蛋白浓度，调整每个样品蛋白浓度为2 μg/μL；制胶(浓度10%)、上样(20 μg)、电泳，电泳结束后，使用转移电泳装置，将蛋白转移到PVDF膜上；室温封闭1 h，孵育一抗GAPDH(1∶4 000)、ERK1(1∶1 000)、p-ERK1(1∶1 000)、DNMT1(1∶500)，4 ℃过夜，TBST洗膜4次，8 min/次；二抗室温下孵育PVDF膜1.5 h，洗膜4次，8 min/次；ECL法结合X光片显影。Image-J软件对蛋白条带进行灰度值分析，目的蛋白与内参GAPDH条带灰度值比较计算ERK1、p-ERK1、DNMT1的相对表达量，实验重复6次，取平均值。

2 结果

2.1 各组细胞ERK1/2、DNMT1 mRNA相对表达量比较 细胞ERK1/2、DNMT1 mRNA相对表达量比较见表1。

表1 各组细胞ERK1/2、DNMT1 mRNA相对表达量比较

注：与其余两组比较，*P<0.05。

2.2 各组细胞ERK1、P-ERK1、DNMT1蛋白相对表达量比较 细胞ERK1、P-ERK1、DNMT1蛋白相对表达量比较见表2。

表2 各组细胞ERK1、P-ERK1、DNMT1蛋白相对表达量比较

注：与其余两组比较，*P<0.05。

3 讨论

肺癌是目前肿瘤相关死亡的首要原因，其中NSCLC占全部肺癌的85%左右，是常见的病理学类型。尽管以手术切除结合生物靶向、放化疗的综合治疗使早期肺癌(Ⅰ期)的5年生存率达80%，然而有效的早期诊断手段缺乏使大多数患者在就诊时已属晚期(Ⅲb期和Ⅳ期)，5年生存率不足10%[4]。原癌基因低甲基化会引起癌基因激活，促进肿瘤生长及转移，抑癌基因高甲基化可导致抑癌基因正常转录、翻译及表达受阻，不能发挥正常的抑瘤作用，最终细胞出现异常增殖，直至肿瘤发生。DNMTs催化完成癌细胞相关基因异常甲基化，是调控表观遗传学DNA甲基化的重要分子，DNMT1包含具有调节功能的较大N-末端结构域和催化功能的较小C-末端结构域[8]，主要起维持甲基化酶作用，对抑制人癌细胞中抑癌基因的活性有重要作用，其表达升高被发现是肿瘤细胞早期分子改变的一个特征[9,10]

RNAi可特异性降解细胞内同源序列的mRNA，阻断特定基因表达，被认为是一种双链RNA诱发的基因沉默现象[11,12]。慢病毒介导的RNAi能够在哺乳动物的细胞内稳定表达siRNA，且具有长期抑制基因表达，不易引起宿主免疫反应等特性[13]。因此，慢病毒介导RNAi已成为当前基因治疗载体研究的热点[14]。本研究通过利用慢病毒载体转染细胞，我们获得了稳定表达LV-ERK1-RNAi和阴性病毒细胞；成功构建了人NSCLCNCI-H1299细胞的ERK1基因沉默细胞。经由RT-PCR检测证明该ERK1 RNAi慢病毒载体在NCI-H1299细胞中具有显著的ERK1基因沉默效率。

作为MAPK信号通路的主要成员，ERK在肺癌组织中高水平表达[15]。一旦在细胞质中被激活，ERK1/2易位到细胞核中并与核底物相互作用以诱导特定的基因表达程序。近来研究显示，该途径的失调与肿瘤表观遗传的许多方面有关[16]。活性ERK磷酸化许多细胞质和核靶标，包括激酶、磷酸酶、转录因子和细胞骨架蛋白。持续的ERK信号传导不仅促进这些基因的磷酸化和稳定化，并可以抑制抑制增殖的基因表达[17]。通常认为ERK1和ERK2基于它们的高序列同源性(85%)发挥相同的作用[18]。然而，有报道确定ERK1与ERK2具有同种型特异性功能，导致其信号传导存在差异性，ERK2而非ERK1是细胞死亡的原因[18,19]。Fremin等[20]发现，在NIH-3T3细胞中，几乎完全去除ERK1不影响细胞增殖，而同样手段减少ERK2水平则显着降低细胞增殖。在增殖的肝细胞中，仅去除ERK2减缓细胞增殖，然而在HeLa细胞[21]和卵巢癌细胞中[22]，去除ERK1或ERK2减缓了细胞增殖。实验中我们用干扰RNA单一沉默ERK1，经由RT-PCR检测ERK2 mRNA水平，与对照NC组比较，KD组表达轻度升高，无统计学意义，不排除由于ERK1的敲低导致剩余ERK2的过度激活[23]。

总之，LV-ERK1-RNAi转染后NCI-H1299细胞 ERK1、DNMT1 mRNA及ERK1、p-ERK1、DNMT1蛋白表达降低，ERK2表达正常，表明LV-ERK1-RNAi特异敲低ERK1而调控DNMT1的表达。