2型糖尿病大鼠辛伐他汀灌胃治疗后胸主动脉壁细胞凋亡情况及细胞凋亡相关基因、活性氧簇表达观察

姚蓉飞，刘鹏，任秋月，周胜男，常柏

1天津医科大学朱宪彝纪念医院，天津 300134；2天津市内分泌研究所；3国家健康委员会激素与发育重点实验室；4天津医科大学；5天津中医药大学；6泰达国际心血管病医院

随着我国经济的发展和人们生活水平的提高，糖尿病的患病率呈现迅猛增长趋势，其中2型糖尿病(T2DM)约占糖尿病患者的90%。大血管病变是糖尿病常见的慢性并发症之一，也是导致糖尿病患者致残和致死的主要原因。通过调节细胞凋亡相关基因的表达，就有可能改善血管内皮细胞的凋亡情况，从而延缓糖尿病大血管病变的发生和发展。以往大量研究证实，他汀类药物在抗血管炎症、抗血栓、抗氧化应激、免疫调节、改善内皮细胞功能及抗凋亡等有显著效果[1]。周卫凤等[2]通过建立体外高糖诱导的内皮细胞模型，发现辛伐他汀对血管内皮细胞的保护作用可能与细胞凋亡有关，但其作用机制尚不明确。糖尿病大血管病变主要涉及心、脑血管等，因此本研究选取糖尿病大鼠胸主动脉为研究对象。本研究通过制备大鼠T2DM模型，并灌胃给予辛伐他汀，观察T2DM大鼠辛伐他汀灌胃治疗后胸主动脉壁病理组织学、细胞凋亡情况及细胞凋亡相关基因、ROS表达情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠60只，4周龄，体质量(100.3±2.2)g，由天津实验动物中心提供[动物合格证号：SCXK(津)2014-001]。

1.2 药物、试剂及仪器 链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司；辛伐他汀片购自辉瑞制药有限公司(10 mg/片，产品批号国药准字J20070060)。超纯RNA提取试剂盒购自天津生化科技有限公司,大鼠活性氧(ROS)ELISA试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司。PCR扩增仪；5810R台式低温高速离心机；JEM-1230透射电子显微镜。

1.3 T2MD模型制备、分组及辛伐他汀灌胃方法 取SD雄性大鼠60只，适应性喂养1周。随机选取40只大鼠，给予高脂饲料(20%蔗糖+1%胆固醇+10%猪油+5%蛋黄粉+0.2%胆酸钠+63.8%普通饲料)喂养，8周后采用尾静脉注射STZ(30 mg/kg)诱导方法制备T2DM模型[3]；制模3 d后，对大鼠尾静脉采血测血糖，随机血糖超过16.9 mmol/L的大鼠视为T2MD大鼠模型成功制备；最终造模成功的大鼠34只，未成模大鼠直接剔除；成模后的T2DM大鼠，按体质量、血糖分层随机分为辛伐他汀组、模型组各17只。另选取20只大鼠作为正常对照组，给予标准饲料喂养。根据人鼠等效剂量，辛伐他汀组以1.05 mg/(kg·d)辛伐他汀溶液灌胃1次，模型组和正常对照组每日给予等量无菌饮用水灌胃1次，各组大鼠灌胃时间均为16周。

1.4 大鼠胸主动脉内皮细胞透射电镜病理变化 16周后，各组大鼠以颈椎脱臼处死后，每组解剖7只大鼠，分离胸主动脉组织2 cm左右。标本切成0.9 mm3大小，在4 ℃下用2%戊二醛固定后，脱水处理，用环氧树脂812浸泡、包埋，经柠檬酸铅双重染色后切片。在透射电镜下观察内皮细胞病理改变。

1.5 大鼠胸主动脉Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA检测方法 每组取10只大鼠处死，取胸主动脉组织，采用Real-time PCR法检测胸主动脉组织中Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA。用超纯RNA提取试剂盒提取组织样本中总RNA。取5 μL RNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳，以检测RNA的完整性。使用DNase Ⅰ试剂盒对RNA中残留的基因组DNA进行消化处理后，HiFi-MMLVcDNA第一链合成试剂盒进行反转录。所用引物序列如下：Apaf-1 PCR扩增片段长度为149 bp，上游引物5，-TATGCAAGAACTCTGCCATC-3′，下游引物5′-GAATGCCACGTACTCAAGGT-3′；Bcl-2扩增片段长度为112 bp，上游引物5′ -TGCCACCTGTGGTCCATCTG-3′，下游引物5′-TGAAGAGTTCCTCCACCA-3′；Bax扩增片段长度为129 bp，上游引物5′-TCATCCAGGATCGAGCAG-3′，下游引物5′-CGTGTCCACGTCAGCAATCA-3′；AIF扩增片段长度为137 bp，上游引物5，-TAAGCCATACTGGCATCAGTC-3，下游引物5′-ACTCTCCGAACGGATACCAG-3′；Caspase-3扩增片段长度为142 bp，上游引物5′-TACTGCCGGAGTCTGACTG-3′，下游引物5′-CTCCAGGAATAGTAACCAGG-3′。应用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采取2-ΔΔCT法进行数据的相对定量分析。

1.6 大鼠胸主动脉ROS检测方法 处死各组大鼠前1 h，股动脉取血3 mL，使自然凝固后离心，取上层血清，用于酶联免疫吸附法检测。用梯度稀释的方式加样，混匀，然后按照ROS ELISA试剂盒使用说明书进行试验。结果以OD值表示。

2 结果

2.1 各组大鼠胸主动脉内皮细胞电镜下变化 正常对照组内皮细胞细胞核清晰，形态完整，有条索样连接紧密、连续(图1a)；模型组内皮细胞可见明显细胞核固缩、线粒体肿胀，及内皮细胞碎片(图1b)；辛伐他汀组较模型组病理损伤较轻，内皮细胞相对连续，完整，有轻度肿胀，但未见明显细胞核固缩(图1c)。

图1 各组大鼠胸主动脉内皮细胞电镜下形态

2.2 各组大鼠胸主动脉Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA及ROS表达比较 大鼠胸主动脉Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA及ROS表达比较见表1。

表1 各组大鼠胸主动脉Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA及ROS表达比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

3 讨论

研究[4,5]显示，糖尿病已成为严重危害我国人民健康的三大慢性疾病之一，而高糖环境诱导血管内皮细胞凋亡是糖尿病导致动脉粥样硬化病变的关键环节。糖尿病大血管病变导致的心、脑、下肢动脉及外周大血管损伤，是糖尿病患者死亡的主要原因。临床常见心血管疾病包括急性冠状动脉综合征，陈旧性心肌梗死、稳定性或不稳定性心绞痛等，糖尿病都是其独立危险因素。而糖尿病导致的以下肢麻木、静息痛、间歇性跛行、皮温低等明显症状的下肢血管病变，严重影响患者的生存质量。根据大量临床试验研究显示，单纯严格控制血糖对糖尿病大血管病变在短期内无明显获益[6]。

辛伐他汀是糖尿病、心血管不良事件一线预防药物，广泛应用于临床。他汀类药物含有羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，其能够有效降低总胆固醇的合成，同时通过促进LDL-c的分解，从而降低LDL-c水平。根据美国糖尿病学会(ADA)的建议，无论基线低密度脂蛋白胆固醇浓度如何，糖尿病患者和年龄在40～75岁的心血管病史都应给予他汀类药物[7]。一些大规模的随机对照试验证实，他汀类药物在预防糖尿病患者心血管疾病发病率和病死率方面的功效[8]。一项荟萃研究显示，他汀类药物可使糖尿病患者的冠状动脉事件减少21%，中风减少36%[9]。同时临床试验表明，辛伐他汀能够有效降低T2DM患者体内炎症因子如白介素-6、肿瘤坏死因子α等的释放，从而降低其全身炎症反应[10]。任天舒等[11]发现，他汀类药物可以有效提升超氧化物歧化酶高活性，从而增强机体对自由基的能力清除能力，减少氧化形成氧化型低密度脂蛋白生成，减少其对组织的损伤，最终抑制血管斑块的形成。本研究显示，在电镜下，模型组大鼠内皮细胞可见明显细胞核固缩、线粒体肿胀；而辛伐他汀组内皮细胞损伤则明显较模型组轻，内皮细胞相对完整。说明辛伐他汀能够有效保护血管内皮，延缓糖尿病大血管病变的发展。

文献[12]报道，血管内皮损伤在糖尿病前期就已存在，内皮细胞凋亡是糖尿病大血管病变的始动因素。内皮细胞凋亡不仅造成血管内皮结构的损害，还严重影响内皮细胞的正常功能，促进血管病变的发生。细胞凋亡的经典通路中，而线粒体通路是最为主要的。当细胞受到一定刺激诱导线粒体通透转换孔开通，引起线粒体外膜透化(MOMP)，后线粒体膜电位(MMP)去极化，MMP的丢失可触发线粒体释放细胞色素C和膜间蛋白AIF被释放将进入细胞质中[13,14]。AIF在细胞质中发生AIF线粒体核转位，引起DNA裂解[15～17]。而Apaf-1在细胞凋亡途径中通过与细胞色素C的相互作用，形成凋亡小体，诱导凋亡发生标志酶Caspase-3的活化引起Caspase级联反应[18]，进而裂解核蛋白、细胞骨架、内质网等，造成典型的凋亡形态学改变。Bcl-2家族蛋白也在细胞凋亡过程中起到了重要作用。Bcl-2家族蛋白是由促凋亡和抗凋亡两部分组成，能够抑制或激活MOMP，从而决定细胞是否发生凋亡。其中Bcl-2与Bax分别为抑制细胞凋亡因子和促进细胞凋亡因子，其作用完全相反。Bcl-2作用于线粒体外膜，其抗凋亡作用主要是通过抑制细胞色素C释放和Caspases的激活。而Bax作为Bcl-2家族蛋白之一，能够导致MOMP促使细胞凋亡，这可能是由于其构象发生改变造成寡聚化，在线粒体外模形成孔道而产生的。同时Bcl-2能够直接或间接阻止Bax与MOMP结合，从而抑制细胞凋亡。ROS是含氧化合物的总称。研究发现，高糖能够刺激细胞ROS的生产，当血管内皮细胞氧化应激损伤后，ROS可引起细胞膜通透性发生改变，最终诱发细胞膜的双层结构断裂，促使细胞凋亡。本研究结果显示，与模型组相比较，辛伐他汀组Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax mRNA及ROS表达降低，Bcl-2 mRNA表达升高，说明在高糖环境下辛伐他汀可以有效的下调促细胞凋亡基因，升高抑制细胞凋亡基因表达水平，从而减少内皮细胞的凋亡进而延缓T2DM大血管病变发生发展。

总之，辛伐他汀可抑制T2DM)大鼠胸主动脉内皮细胞凋亡，机制可能为其可下调Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax mRNA及ROS表达，上调Bcl-2 mRNA表达。