Graves病甲亢患者外周血25-OH-D3、IL-4、TR-Ab水平及CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分比变化观察

李晓通，李莉华

1天津市南开医院，天津300100；2天津市北辰医院

Graves病(GD)又称弥漫性毒性甲状腺肿，是一种常见的自身免疫性疾病，患者在多种因素影响下出现免疫功能异常，产生甲状腺刺激性抗体主要是促甲状腺激素受体抗体(TR-Ab)，从而导致甲状腺功能亢进。GD的自身免疫机制研究不断进展，发现GD患者体内存在调节性T细胞(Treg细胞)的数量减少或功能缺陷，辅助性T细胞Th1、Th2平衡的紊乱[1]。白细胞介素-4(IL-4)为Th2细胞分泌的重要细胞因子，可能在疾病发展中发挥作用。维生素D对免疫系统的调节作用不断被发掘，包括诱导Treg细胞来促进免疫耐受，以及具有调控Th1/Th2的免疫平衡的作用[2]。25-羟维生素D3(25-OH-D3)为体内维生素D储备情况的评价指标，25-OH-D3水平下降可能与多种自身免疫性疾病包括GD发病相关[3]，但其作用机制仍不完全清楚。本研究通过观察GD甲亢患者血清25-OH-D3、IL-4水平及外周血Treg细胞数量的变化，探讨各指标之间相关性及补充维生素D对疾病治疗的意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年1～12月天津市北辰医院收治的GD甲亢患者40例[观察组，合并维生素D缺乏(25-OH-D3<20 ng/mL)18例，不缺乏者22例]，男10例，女30例；年龄18～70(41.2±16.4)岁。纳入标准：观察组诊断符合《中国甲状腺疾病诊治指南-甲状腺功能亢进症》关于GD甲亢的诊断标准[4]。游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)为(21.48±11.32)pmol/L，高于正常范围(3.8～6.0 pmol/L)，游离甲状腺素(FT4)为(47.21±20.84)pmol/L，高于正常范围(7.86～14.41 pmol/L)，促甲状腺素(TSH)为(0.01±0.00)uIU/mL，低于正常范围(0.34～5.60 μIU/mL)，TR-Ab均阳性。排除标准：排除其他病因所致甲亢，排除急慢性感染、肿瘤、器官移植术后、严重器质性疾病、妊娠及其他自身免疫性疾病家族史者。选择同期20名性别、年龄相匹配的健康体检者为对照组，男4例，女16例；年龄18～70(43.6±14.2)岁。两组一般资料无统计学差异，具有可比性。本研究已通过天津市北辰医院伦理委员会审核，研究对象均知情同意并签署知情同意书。

观察组均全程接受抗甲状腺药物甲巯咪唑治疗，每次10 mg，2～3次/d，每3～4周复查甲状腺功能至正常后逐渐减量维持治疗，治疗至1 年观察结束时均已达到甲状腺功能正常的维持阶段(缓解期)。对观察组中维生素D缺乏者同时接受补充维生素D治疗，予阿法骨化醇软胶囊0.25 μg，1次/d，共治疗3个月停药。

1.2 检测方法 采用串联质谱法检测血清25-OH-D3，化学发光法检测TR-Ab，ELISA法检测IL-4，流式细胞术检测外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数量，以CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T细胞百分比表示。对照组及观察组治疗前均检测上述指标。观察组治疗1年进入缓解期时再次检测TR-Ab、IL-4、CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比，其中合并维生素D缺乏者于维生素D治疗3个月后加测一次上述三个指标。

2 结果

2.1 两组血清25-OH-D3、IL-4、TR-Ab水平及外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数量比较 血清25-OH-D3、IL-4、TR-Ab水平及外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分比比较见表1。

表1 两组血清25-OH-D3、IL-4、TR-Ab水平及外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.2 观察组25-OH-D3与TR-Ab、CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比、IL-4的相关性分析 观察组25-OH-D3水平与TR-Ab呈负相关(r=-0.83、-0.73，P均<0.05)，与CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比呈正相关(r=0.56，P<0.05)。

2.3 观察组25-OH-D3缺乏者治疗前后血清TR-Ab、IL-4及外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比比较 治疗前、维生素D补充3个月及治疗1年缓解期血清TR-Ab、IL-4及外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比比较见表2。

2.4 观察组25-OH-D3不缺乏者治疗前后血清TR-Ab、IL-4及外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比比较 治疗前和治疗1年缓解期血清TR-Ab、IL-4及外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比比较见表3。

表2 观察组25-OH-D3缺乏者治疗前后血清TR-Ab、IL-4及外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比比较

注：与治疗前比较，*P<0.05。

表3 观察组25-OH-D3不缺乏者治疗前后血清TR-Ab、IL-4及外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比比较

注：与治疗前比较，*P<0.05。

3 讨论

GD是一种常见的自身免疫性甲状腺疾病，在遗传、环境、免疫多种因素作用下，机体出现免疫应答异常而致病，是导致甲亢的最常见病因。GD特征性的自身抗体为TR-Ab，可作为疾病诊断标志。GD病理特点为滤泡上皮的增生肥大，淋巴细胞浸润。其发病机制尚不完全清楚，但多种免疫机制包括体液免疫及细胞免疫紊乱参与其中，尤其辅助性T细胞(Th细胞)、Treg细胞的失衡，破坏甲状腺免疫耐受，相关免疫因子异常增多刺激B淋巴细胞产生甲状腺刺激性抗体是其核心机制[1,2]。

维生素D是一种重要的调节骨代谢维生素，1,25-(OH)2-D3是其活性形式，体内维生素D水平的评价主要是25-OH-D3。同时维生素D具有免疫调节功能，在自身免疫性甲状腺疾病包括GD中同样有重要作用。多个研究[5～7]发现，GD甲亢患者存在维生素D水平下降，但与自身抗体TR-Ab水平之间的相关性仍不统一。有研究认为，维生素D水平下降是GD发病或停药复发的危险因素[8,9]。同样在本研究中，我们也发现GD甲亢患者较健康对照组25-OH-D3水平明显下降，存在维生素D缺乏，同时25-OH-D3水平与TR-Ab水平负相关，与Yasuda等[7]的研究结果相一致，提示它可能参与GD的发病，尤其与自身抗体生成相关。但同时我们看到，无论有无维生素缺乏，GD甲亢患者在抗甲状腺药物治疗甲亢得到缓解后维持阶段，其自身抗体均较前有明显下降，提示抗甲状腺治疗本身对抗体滴度的影响，而维生素D治疗是否有进一步的获益还需设计不同治疗对照组研究证实。

Treg细胞属于CD4+T淋巴细胞家族，分为不同亚型，其中CD4+CD25+Treg细胞在维持外周免疫耐受中发挥重要作用。Foxp3是转录因子叉头样/翼状螺旋家族的成员，主要表达于CD4+CD25+Treg细胞，是其发育和功能的重要分子。既往研究报道，在GD中存在Treg细胞减少和/或功能缺陷[10,11]。本研究中GD甲亢患者也存在CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数量减少，并且25-OH-D3水平与CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数量呈正相关，这可能与维生素D的免疫调节作用相关。维生素D有调节淋巴细胞的增殖及细胞因子的分泌和抗原递呈细胞的分化等作用，还可调节Treg细胞的活性和数量[12,13]。动物研究中维生素D缺乏小鼠Treg细胞数量明显减少，Treg基因敲除小鼠模仿维生素D缺乏状态，其甲亢症状明显加重[14]。这提示维生素D与Treg细胞共同参与GD甲亢发病，并可能有密切相互联系。但遗憾的是，在本研究中维生素缺乏组维生素D补充治疗及甲亢完全缓解后Treg细胞比例均无明显变化，未能看到维生素D补充治疗对Treg细胞缺乏状态的改善。但由于本研究样本数量较小存在一定局限性，其间的联系性仍需进一步研究。

IL-4是Th2细胞表达细胞因子之一，有加强体液免疫反应、促进抗体生成的作用。以往研究发现GD甲亢患者中存在Th1/Th2失衡向Th2偏移，促进TR-Ab产生[15]。本研究发现GD甲亢患者治疗前IL-4水平明显升高，再次说明Th2细胞以及IL-4在GD甲亢的发病中可能发挥重要作用。维生素D水平与之负相关，也为维生素D的可能作用机制提供了又一线索。并且本研究中，尽管GD甲亢合并维生素D缺乏组在维生素D补充治疗3个月后IL-4水平没有明显变化，但在缓解期IL-4水平较前有明显下降，与之不同的是GD甲亢维生素D正常组仅仅接受抗甲状腺药物治疗而无维生素D补充治疗，当缓解期甲亢好转时IL-4水平与治疗前比无明显变化，这说明单纯抗甲状腺药物治疗缓解甲状腺功能异常没有改善IL-4的升高，Th2细胞免疫异常无好转，而GD甲亢合并维生素D缺乏组的改善可能来源于维生素D补充治疗，提示维生素D可能在疾病中对IL-4水平有调节作用。但本研究为间接推测，还需更多的病例对照临床实验研究证实，维生素D具体作用通路也需探讨。并且目前有研究关注到维生素D补充治疗对于降低GD复发风险及心血管风险的益处[16，17]，未来需进一步评价维生素D补充在GD甲亢治疗中的获益与风险。

总之，GD甲亢患者血清25-OH-D3水平下降，CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞减少，细胞因子IL-4水平的升高，25-OH-D3水平与TR-Ab、IL-4水平负相关，与CD4+CD25+Foxp3+Treg数量呈正相关，通过对缺乏维生素D患者补充治疗，可使其IL-4水平有下降，可能对患者免疫功能调节具有一定作用。