浙东地区耐多药结核分枝杆菌耐药特性及分子机制研究

石庆新 陆如岳 於青峰 涂茜 李蒿蒿 蔡莺莺 周秋菊 周凯 王冬莲

[摘要] 目的 对浙东地区耐多药结核分枝杆菌（MDR-TB）耐药性及分子机制进行研究，为治疗耐多药结核病提供理论依据。 方法 收集2018年1月～2019年12月浙江东部9家结核病定点医院临床分离的结核分枝杆菌。采用比例法检测异烟肼（INH）、利福平（RIF）、氧氟沙星（OFL）、链霉素（SM）、乙胺丁醇（EMB）、阿米卡星（AK）、对氨基水杨酸（PAS）、卷曲霉素（CM）和丙硫异烟胺（TH）对MDR-TB的耐药性。通过基因芯片方法检测耐多药结核分枝杆菌rpoB、katG、inhA突变位点，PCR扩增OFL耐药的MDR-TB的gyr耐药基因并测序。 结果 耐多药结核分枝杆菌对OFL、SM、EMB、AK、PSA、CM、TH、INH和RIF耐药率分别为38.1%、54.8%、28.6%、11.9%、8.3%、9.5%、13.1%、100.0%和100.0%。耐多药结核分枝杆菌的突变位点为rpoB 511（9例）、rpoB 513（3例）、rpoB 516（3例）、rpoB 526（25例）、rpoB 531（38例）、rpoB 533（2例），KatG 315（71例），inhA-15（4例），KatG 315与inhA-15同时突变（9例）。检测到26株gyrA基因和2株gyrB基因发生突变，突变类型为Thr478Asn、Asn477Thr、Ala90Val、Ser91Pro、Asp94Ala、Asp94His、Asp94Asn和Asp94Gly。 结论 耐多药结核分枝杆菌利福平耐药以rpoB基因531位点突变为主;异烟肼耐药以KatG基因315位点突变为主;MDR-TB对喹诺酮类药物的耐药机制以gyrA基因Ala90Val、Ser91Pro、Asp94Gly突變类型为主。

[关键词] 结核分枝杆菌;耐多药;基因芯片;基因突变

[中图分类号] R52          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）34-0005-04

[Abstract] Objective To study the drug resistance and molecular mechanism of multi-drug resistant mycobacterium tuberculosis（MDR-TB） in eastern Zhejiang province， and to provide theoretical basis for the treatment of MDR-TB. Methods Mycobacteria tuberculosis that were clinically isolated in 9 designated tuberculosis hospitals in eastern Zhejiang province from January 2018 to December 2019 were collected. The drug resistance of MDR-TB to isoniazid（INH）， rifampicin（RIF）， ofloxacin（OFL）， streptomycin（SM）， ethambutanol（EMB）， amikacin（AK）， para-aminosalicylic acid（PAS）， capreomycin（CM） and propyl thionisocyanamine（TH） was detected by the ratio method. The rpoB， katG and inhA mutation sites of MDR-TB were detected by the gene chip method. The gyr resistance gene of OFL-resistant MDR-TB was amplified by PCR and sequenced. Results The drug resistance rates of MDR-TB to OFL， SM， EMB， AK， PSA， CM， TH， INH and RIF were 38.1%， 54.8%， 28.6%， 11.9%， 8.3%， 9.5%， 13.1%， 100.0% and 100.0%， respectively. The mutational sites of MDR-MTB were rpoB 511（9 cases）， rpoB 513（3 cases）， rpoB 516（3 cases）， rpoB 526（25 cases）， rpoB 531（38 cases）， rpoB 533（2 cases）， KatG 315（71 cases）， inhA-15（4 cases）， KatG 315 and inhA-15 simultaneously（9 cases）. Mutations were detected in 26 gyrA genes and 2 gyrB genes， and the mutation types were Thr478Asn， Asn477Thr， Ala90Val， Ser91Pro， Asp94Ala， Asp94His， Asp94Asn and Asp94Gly. Conclusion The major mutation site of genes in MDR-TB resistant to rifampicin is rpoB 531. The major mutation site of genes in MDR-TB resistant to isoniazid is KatG 315. The resistance mechanism of MDRTB to quinolones is mainly gyrA gene Ala90Val， Ser91Pro and Asp94Gly mutations.

[Key words] Mycobacterium tuberculosis; MDR; Gene chip; Genetic mutation

耐多药结核分枝杆菌（Multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis，MDR-TB）对异烟肼和利福平同时耐药[1]，其对一线药物通常协同耐药，常表现为多重耐药，在临床上耐多药结核分枝杆菌治愈率低。中国是MDR-TB全球流行最严重的国家之一[2]。我国新疆地区MDR-TB患者治疗2年的累积病死率高达45.9%[3]。因此MDR-TB预防和治疗形势非常严峻，已成为我国结核病防控的最大难题。为了解浙东地区MDR-TB耐多药现状，现对2018年和2019年临床分离得到的MDR-TB药物敏感性和分子检测实验结果进行分析，为临床治疗耐多药结核病方案提供参考，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株  从2018年1月～2019年12月浙江东部9家结核病定点医院[台州恩泽医疗中心（集团）恩泽医院、温岭市第一人民医院、台州市立医院、台州市第一人民医院、仙居县人民医院、三门县人民医院、临海市第一人民医院、玉环市第一人民医院和天台县人民医院]收集临床分离的1064株结核分枝杆菌。纳入标准：来自以上几家医院的初诊和复诊结核患者首次分离出结核分枝杆菌（剔除重复分离的菌株），其中耐多药结核分枝杆菌84株（7.9%）。

1.1.2 试剂与仪器  固体比例法培养基噻吩-2-羧酸肼（Thiophene-2-carboxylic acid hydrazine，TCH）、对硝基苯甲酸（P-nitrobenzoic acid，PNB）、链霉素（Streptomycin，SM）、利福平（Rifampicin，RFP）、异烟肼（Isoniazid，INH））、乙胺丁醇（Ethambutol，EMB）、阿米卡星（Amikacin，AK）、氧氟沙星（Ofloxacin，OFL）、对氨基水杨酸（P-aminosalicylic acid，PAS）、丙硫异烟胺（Propylthioisonicotinamide，PTO）、卷曲霉素（Capreomycin，CM），均购于珠海贝索生物技术有限公司。液体培养试剂（美国BD公司）、分枝杆菌耐药基因芯片检测试剂（成都博奥生物科技有限公司）。MGIT960结核分枝杆菌培养仪（美国BD公司）、BIO-RAD T100TMPCR扩增仪（美国Bio-Rad公司）、Extratocr 36DNA提取仪、BioMixerTMⅡ芯片杂交和LuxScan-10K/B 微阵列芯片扫描仪（北京博奥生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 设计引物  根据参考文献[4-5]设计引物，gyrA：P1 5'-CCGGATCGAACCGGTTGACAT-3'，P2 5'-GGGCT TCGGTGTACCTCAT-3';gyrB：P1 5'-AACACCGAGGT CAAATGGTT-3'，P2 5'-CTGAATGCCGTCTTCCTTG TTGT-3'。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 药敏试验  严格按照《结核病诊断细菌学检验规程》使用液体药敏培养法检测1064株结核分枝杆菌对利福平和异烟肼敏感性。采用比例法对耐多药结核分枝杆菌进行INH、RIF、SM、EMB、AK、OFL、PAS、TH、CM的药敏试验和结果判读。

1.2.3 耐多药基因突变位点的检测  （1）核酸提取：加入80 μL DNA提取液至提取EP管中，再加入20 μL 1.0麦氏浓度的菌悬液，放入核酸提取仪振荡提取10 min，95℃金屬浴5 min，低温12 000 r/min离心1 min。（2）核酸扩增：将每个标本提取的核酸进行3管扩增反应，分别在每管加入1、2、3号扩增试剂18 μL和2 μL的DNA模板。放入PCR仪中扩增。扩增条件：37℃ 10 min;94℃ 10 min、94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 40 s进行35个循环;94℃ 30 s、72℃ 60 s进行10个循环;72℃ 420 s。（3）核酸杂交扫描：杂交的混合液95℃ 5 min，冰水浴5 min。吸出 13.5 μL混合液加入杂交芯片样品孔中，置于50℃ BioMixerTMⅡ芯片杂交仪中杂交120 min。杂交结束后，洗涤芯片并甩干，放入LuxScan-10K/B微阵列芯片扫描仪读取结果。（4）扩增产物测序：PCR扩增体系：1 μL上下游引物（10 μmoL/L）、1 μL模板DNA（100 mg/L）、1.5 μL MgCl2（25 mmol/L）、2.5 μL10×ABI Buffer、0.125 μL ABI AmpliTaq（5 U/μL）、2 μL dNTP（2.5 mmol/L）、15.875 μL去离子水，合计共25 μL。扩增条件：90℃预变性5 min;95℃ 30 s、60℃ 30 s、72 ℃ 45 s，进行40个循环;最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物纯化后放入ABl3730测序仪进行双向DNA序列测定，使用美国ABl3730自动测序仪采用Sanger测序法对扩增gyrA和gyrB基因片段进行测序。

1.3 统计学方法

采用Excel 2010录入检测数据，通过Backlink转换成Whonet文件，导入Whonet5.6软件采用数值比例法对耐药数据进行分析。

2 结果

2.1 初治组和复治组耐多药患者对不同药物的耐药情况比较

对1064株结核分枝杆菌进行耐多药筛选，检出84株耐多药结核分枝杆菌，阳性率为7.9%;其中初治耐多药结核分枝杆菌为14株（16.7%），复治耐多药结核分枝杆菌为70株（83.3%）。84株耐多药结核分枝杆菌对OFL的耐药菌株有32株（38.1%）。见表1。

2.2 MDR-TB的katG、inhA和rpoB基因突变位点分布

基因芯片法检测耐多药结核分枝杆菌对INH药物突变位点有3种类型，以katG 315位点为主，对RIF药物常见的突变位点6种类型进行检测，发现rpoB 511、rpoB 513、rpoB 516、rpoB 526、rpoB 531、rpoB 533突变位点均有检出。见表2、封三图1。

2.3 喹诺酮耐药gyr基因突变

对32株OFL耐药的MDR-TB进行gyr基因测序结果，检到28株耐药菌株发生了突变，其突变率为87.5%（28/32），其中gyrA基因Asp94Gly突变8株、Ser91Pro突变7例、Ala90Val突变6例、Asp94His突变2例、Asp94Ala突变2例、Asp94Asn突变1例;发现有2例gyrB基因发生突变，突变率为6.3%。见表3、封三图2。

3 讨论

目前，中国是世界结核病高负担国家，活动性肺结核和耐多药结核病患者例数均排在全球第三位。了解我国结核分枝杆菌耐多药及突变位点的情况，对预防控制我国结核病的流行和传播有非常重要的作用。申秀丽等[6]报道青海省耐多药比例为30.93%，高于2010年全国第五次流行病学调查耐多药比例的6.8%。本研究结果显示，耐多药结核分枝杆菌比例为7.9%，与余旭良等[7]报道的浙江衢州地区的耐多药比例接近。本研究结果显示，浙江省东部地区结核分枝杆菌的耐多药比例接近全国平均水平，低于西部省份。可能由于中国东部沿海地区经济比较发达，新设备和新技术更易推广，可缩短检测时间，临床医生较早可根据检测药敏报告及时调整用药方案，减少耐多药结核分枝杆菌产生;同时人们受到的教育文化程度高，有较好的健康理念，也可减少结核病传播。

RIF耐药菌株的突变位置发生在rpoB81bp耐药决定区（编码密码子507～533位），以531、526、516位点突变为主。本研究检测耐多药结核分枝杆菌对RIF主要突变位点为rpoB 531（53.3%）、526（29.7%）。国内外研究表明，结核分枝杆菌RIF耐药基因位点及突变率在不同地区存在一定的差异性[8-11]。这些位点的突变仅改变了自身氨基酸，使细菌部分结构发生改变，影响药物与细菌结合，并未对自己造成损害。临床检测这些位点的突变，能够快速有效地筛选出RIF耐药的结核分枝杆菌。

本研究在INH耐药菌株中检测到katG和inhA两个基因都发生了突变，产生三种的突变类型katG 315、inhA-15、katG 315和inhA-15两位点同时突变，以katG 315为主要突变类型。与许榕青等[12]研究INH耐药突变类型基本一致;同其他报道[13-14]有明显差异，在这些研究中仅检出一种或两种突变类型。INH对结核分枝杆菌的耐药机制非常复杂，主要与烯酰脂酰载体蛋白还原酶inh A、katG酶、还原型辅酶脱氢酶NADH、烷基氢过氧化物还原酶oxyR、β-酮酰基酰基运载蛋白合成酶kasA和多基因的多位点突变有关[15]。据文献报道[16]，约70%INH耐药发生在katG 315的突变位点，315位点的氨基酸发生改变，katG基因编码katG酶活性下降或丧失，结核分枝杆菌产生耐药。inhA基因位点突变约占异烟肼耐药菌株的5%～35%[17]。inhA基因编码产生烯酰脂酰载体蛋白还原酶，编码区-15位点发生突变，异烟肼与NADH酶的复合物的亲合力减弱，仅inhA基因突变会引起异烟肼的低浓度耐药，当katG基因和inhA启动子区同时突变时，结核分枝杆菌对异烟肼耐药性增强，提示两者突变对耐药有协同作用[15]。

氟喹诺酮类抗菌药物是治疗耐多药肺结核核心药物，如果出现耐药将会影响结核病二线药物给药方案。耐多药结核分枝杆菌对喹诺酮耐药分子机制主要是gyr基因中耐药决定区发生突变。本研究對32株OFL耐药的MDRTB进行gyr基因测序，检测到28株（87.5%）耐药菌株发生突变，与Rodwell等[18]报道结果相近。结核分枝杆菌喹诺酮药物gyrA耐药决定区突变位点在88～94位密码子，最常见为94位密码子Asp，可由Ala、His、Asn、Gly和Tyr等5种氨基酸替换Asp[19]。本研究也检测到94位密码子Asp被前四种氨基酸替换。Ala90Val、Ser91Pro和Asp94Gly密码子突变是本地区gyrA主要突变类型。实验还检测到2株耐药菌发生gyrB突变，gyrB突变发生率比gryA低得多，与文献报道一致[20]。相关研究表明，gyrB基因突变使喹诺酮药物耐药基因检出率增加12.5%[21]。故gyrB基因的突变在喹诺酮类药物耐药中不可忽略。

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（收稿日期：2020-09-01）