新型生物抗菌修补片抑菌效果和安全性的实验研究

程文悦，刘耀婷，陈金水，王 强，张 剑

生物补片天然具备一定的耐受感染能力，较多地应用于污染创面，是目前应用于伴有污染或感染缺损修复的唯一选择。但不可否认的是，生物补片耐受感染的机制是其能实现早期局部快速再血管化、吞噬细胞早期进入，细菌生物膜难以形成[1]，因此其仅是耐受感染而不是抗感染，其自身并没有抗微生物活性[2]。生物补片应用于修复明显污染或感染的腹壁缺损时失败率仍较高,并且失败的病例均合并有手术部位感染[3]。另有研究提示生物补片能否耐受感染跟植入时定植的细菌量有关，当细菌超过吞噬细胞的清除能力，则生物补片内细菌同样可以形成生物膜，分泌出大量胶原酶导致生物补片迅速崩解[4]。因此，生物补片亟需提升抗感染性。本研究拟筛选合适的抗菌剂与猪小肠黏膜下层脱细胞基质复合制备新型生物抗菌修补片，确认其抗菌性、抗菌剂释放和安全性，为污染创面的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 三氯生(2,4,4-三氯-2-羟基二苯醚，Sigma-Aldrich)、硝酸银(Sigma-Aldrich)、苯扎溴铵(十二烷基二甲基苄基溴化铵，Sigma-Aldrich)、乙醇(国药)、胰酪大豆胨琼脂培养基(上海科玛嘉微生物技术有限公司)、胰酪大豆胨肉汤培养基(上海科玛嘉微生物技术有限公司)、Mueller-Hinton琼脂平板(上海科玛嘉微生物技术有限公司)、二氯甲烷(国药)、甲醇(Thermo)、L929细胞由海军军医大学附属长征医院实验诊断科惠赠。

1.1.2 菌种 金黄色葡萄球菌(ATCC25923，Staphylococcus aureus，Sau)、大肠埃希菌(ATCC25922，Escherichia coli，Eco)、铜绿假单胞菌(ATCC27853, Pseudomonas aeruginosa, Pae)、表皮葡萄球菌(临床质控菌株201413，Staphylococcus epidermidis，Sep)、嗜麦芽窄食单胞菌(ATCC17066，Stenotrophomonas maltophilia，Sma)，由海军军医大学附属长征医院实验诊断科惠赠。

1.2 方法

最低抑菌浓度的筛选采用肉汤稀释法和细菌生物膜形成实验。

1.2.1 供试菌的准备 用无菌接种环沾取Sau、Eco、Pae、Sep、Sma菌株接种于胰酪大豆胨琼脂培养基(tryptose soya agar, TSA)平皿，表面分区划线，37 ℃培养过夜。挑选1～2菌落种植于胰酪大豆胨肉汤培养基(tryptose soya broth, TSB)中，37 ℃、200 r/min(离心半径r=10 cm)振荡培养4 h，取菌液测定吸光度，调整菌液浓度至105CFU/ml)。

1.2.2 肉汤稀释法抑菌效果实验 制备三氯生、硝酸银、苯扎溴铵储备液。96孔板加入100 μl/孔菌液(Sau、Eco、Pae、Sep)和稀释后的100 μl/孔抗菌剂溶液，调整抗菌剂浓度分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/L。设立抗菌剂空白对照和培养基空白对照。37 ℃培养24 h，测定570 nm波长处的吸光度。

1.2.3 细菌生物膜形成实验 96孔板加入200 μl/孔菌液(Sep、Sma)，37 ℃培养24 h。弃菌液，加入无菌PBS(200 μl/孔)洗去未粘附菌，重复洗涤3次。加入100 μl/孔抗菌剂溶液(浓度梯度与肉汤稀释法相同)，37 ℃培养24 h。加入50 μl/孔Bouin固定液，固定1 h。吸出固定液，无菌PBS 洗涤4次。每孔加入1滴0.4%结晶紫染液(以覆盖孔底为准)，染色1 min。轻轻洗去未附着的染料，晾干，测定570 nm波长处的吸光度。以单纯培养基为空白对照。

1.2.4 生物抗菌修补片的制备 以乙醇溶解三氯生，制备为储备液。取新鲜猪小肠，机械去除肠壁肌层、浆膜层和黏膜层，获得猪小肠黏膜下层。Abraham法[5]制备猪小肠黏膜下层脱细胞基质(small intestinal submucosa，SIS)。将三氯生储备液涂布于SIS表面，8层SIS叠加成型，环氧乙烷灭菌后制备为生物抗菌修补片(triclosan-SIS，TSIS)。

1.2.5 抑菌圈实验 调整Eco、Sau菌液浓度至106CFU/ml，均匀涂抹Mueller-Hinton 琼脂平板，37 ℃培养24 h后将裁剪至1 cm×1 cm大小的TSIS补片贴于板面。每日更换新的平板，将补片揭下再次贴于新的板面，同法处理至无抑菌圈为止。每天测量抑菌圈直径(mm)。

1.2.6 体外释放实验 将补片贴于琼脂培养基表面，每天更换培养基。琼脂培养基碾碎后置于10 ml离心管中加入5 ml二氯甲烷，振荡1 min，超声15 min。吸出二氯甲烷微孔过滤；重复提取1次，合并2次滤液；另取一支10 ml离心管加入2 ml滤液和2 ml水，振荡1 min，3 000 r/min(离心半径r=10 cm)离心5 min，弃去上层水相，再加入2 ml水，振荡离心；准确吸取1 ml下层二氯甲烷于1.5 ml离心管中； 30 ℃，2 000 r/min(离心半径r=10 cm)离心后放置过夜，完全挥发二氯甲烷。残渣以500 μl 95%甲醇复溶，振荡1 min，超声15 min，14 000 r/min(离心半径r=10 cm)离心5 min，取200 μl上清进样分析。检测设备为Agilent 6410型高效液相串联质谱，色谱柱ZORBAX SB-C18 (3.5 μm，2.1 mm×100 mm)。色谱条件：洗脱梯度：甲醇与水(95∶5；V∶V)等度洗脱；流速：0.3 ml/min；柱温：25 ℃；进样量：10 μl；运行时间：3 min；retention time：1.29 min。质谱条件：离子源：电喷雾电离源； 极性：负离子模式；扫描方式：多反应监测；母离子：288.9；子离子：35；F值：40；CE值：8。

1.2.7 细胞毒性实验 按照《GB/T 16886.12-2005 医疗器械生物学评价 第12部分：样品制备与参照样品》中的规定，对TSIS补片和SIS补片按照(2 cm×3 cm)/ml的比例制备浸提液，浸提介质为DMEM培养基，浸提条件为37 ℃，24 h。按照《GB/T 16886.5-2003 医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验》中规定的方法进行试验。取对数生长期的L929细胞，调整细胞浓度至1×104/ml，100 μl/孔加至96孔板，37 ℃、5% CO2培养24 h。弃细胞培养上清，加入各组浸提液，每组6个复孔，置37 ℃、5% CO2培养72 h。加入MTT溶液处理4 h，450 nm波长下检测OD值，以空白对照组为100%存活率，计算细胞存活率。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0软件包进行统计学处理，实验数据以均值±标准差(x±s)表示。2组比较采用t检验，3组以上比较采用One-way ANOVA检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 最低抑菌浓度

从硝酸银和苯扎溴铵的浮游菌和细菌生物膜最低抑菌浓度(MIC)实验结果中可以看出，硝酸银对革兰氏阴性菌的抑制作用较好，而苯扎溴铵对革兰氏阳性菌的抑制作用较好。但对生物膜状态的细菌抑制效果较差。三氯生对革兰氏阴性菌和阳性菌均有较好的抑制作用，且在浮游菌和细菌生物膜状态下均能产生明显抑制作用，因此选择三氯生制备抗菌生物补片。见表1。

表1 三氯生、硝酸银和苯扎溴铵的最低抑菌浓度(μg/ml)

注：Sau为金黄色葡萄球菌，Sep为表皮葡萄球菌，Eco为大肠埃希菌，Pae为铜绿假单胞菌，Sma为嗜麦芽窄食单胞菌

2.2 体外抑菌性

TSIS对细菌的抑制作用良好，对大肠埃希菌(革兰氏阴性菌)的抑制作用维持14 d，对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)的抑制作用长达18 d。见表2和图1。

表2 TSIS对不同时间Eco和San的抑菌圈实验结果(mm，x±s，每组n=3)

注：与Eco 3 d比较aP<0.05；与San 7 d比较bP<0.05；与San 24 d比较cP<0.05。Eco为大肠埃希菌，San为金黄色葡萄球菌

图1 体外抑菌圈实验结果。TSIS对Sau处理1 d(A)和24 d(B)的抑菌圈，对Eco处理1 d(C)和7 d(D)的抑菌圈

2.3 三氯生体外释放

体外释放结果(图2A)可以看出，TSIS补片第1～4天突释(402.5±10.1) ng的三氯生，达到较好的早期抗菌效果。第5～14天三氯生释放曲线逐渐平缓，起到较好的持续抗菌效果。见图2。

2.4 细胞活性

TSIS的细胞毒性与未添加抗菌剂的SIS补片无显著性差异(图2B)，细胞存活率为(80.3±5.6)%。

注：aP<0.01，bP<0.001。TSIS为抗菌修补片，SIS为小肠黏膜下层脱细胞基质图2 三氯生体外释放曲线(A)和细胞活性结果(B)

3 讨论

外科术后补片感染是较为严重的并发症，通过预防给药或术后给药的方式并不能有效减少感染的发生[6]。生物补片的定义是指取自同种、异种的组织，经脱细胞处理去除组织中含有的各种细胞而完整保留细胞外基质的三维框架结构、能用于修复人体软组织的材料，与合成补片相比，生物补片拥有生物相容性好、无过量瘢痕组织、无长期慢性炎症、组织粘连轻等优点，是外科修补材料的发展趋势[7]。生物补片具备一定的厚度、透湿性和孔隙率，可以作为抗菌成分的良好释放载体，本研究以常用的生物补片原材料SIS为基础，联合抗菌剂制备出一种可以主动抗菌的新型生物修补片，体外抗菌性实验和抗菌剂释放实验证实补片对研究菌株分别具备7 d和24 d的持续抑制作用，且细胞毒性较低。

本研究中选择临床常用的抗菌剂：三氯生、硝酸银和苯扎溴铵，选择肉汤稀释法(浮游菌)抑菌实验和生物膜形成实验进行筛选。细菌生物膜是多数感染特别是与植入性材料相关的感染发生的诱因，生物膜一旦形成，即使使用千倍剂量的抗生素也难以去除[4]。但本研究发现，硝酸银对革兰氏阴性菌、苯扎溴铵对浮游状态下的革兰氏阳性菌抑菌效果较好，二者对细菌生物膜状态下的革兰氏阴性菌和阳性菌的抑制作用均较差。三氯生是一种广谱抗菌剂，广泛应用于日常精细化工品和抗菌缝线中，在一些生物补片研究中也取得了较好的抑菌效果[8-9]。Hernandez-Richter等[8]制备三氯生复合聚丙烯补片，对猪血管感染模型的治疗效果良好；Berard等[9]发现三氯生复合至银离子胶原补片可以显著提升抑菌性，优化抑菌效果。三氯生的抑菌原理是吸附并穿透细菌细胞壁，对胞质中的脂质和蛋白质产生非特异性反应，造成不可逆变性从而杀死细菌[10]。既往报道深入研究发现三氯生可能存在靶向作用，靶点为脂肪酸合成途径和酰基载体蛋白还原酶[11]。本研究中三氯生对临床常见菌的浮游和生物膜状态均产生良好的抑制作用，特别是对生物膜的MIC显著低于硝酸银和苯扎溴铵，因此本研究选择三氯生为模式抗菌药物。

三氯生的水溶性较低(约10 μg/ml)，单独给药容易聚集，降低抗菌活性[11]。因此本研究将三氯生完全溶解与乙醇溶液中制备储备液，使其可以借助溶液充分、均匀的分散于SIS补片的多层结构间。补片植入后，借助SIS的超微三维网状支架结构，富含粘滞成分，易于吸附的特点，以溶解、扩散作用减缓药物释放。因此，本研究制备的生物抗菌修补片TSIS可以有效、持续地抑制革兰氏阴性菌和阳性菌的生长。以琼脂平板为释放介质，液质联用分析生物抗菌修补片的三氯生释放，发现其释放曲线呈先突释后平稳持续释放的趋势，这可能是由于补片内外形成三氯生浓度差，游离于补片内部的三氯生在可以短时间内迅速释放，与抑菌圈实验结果一致。

按照《GB/T 16886.5-2003 医疗器械生物学评价 第五部分：体外细胞毒性试验》的评价方法，三氯生的加入使补片整体的毒性增加，但与未添加三氯生的SIS补片相比差异无统计学意义，TSIS补片和SIS补片的细胞活性均为Ⅰ级，符合植入型医疗器械的生物安全性要求。

本研究将抗菌剂三氯生与SIS生物补片结合，成功制备出生物抗菌修补片，并证实其具备广谱、持久的抑菌性和生物安全性，为提升生物补片主动抗感染性的设计提供了新的思路。