营参合剂预防晕动病的实验研究

吴慧文，张宏伟，顾 伟，李 敏

当暴露于异常加速度环境，人体会出现眩晕、头痛、出冷汗、恶心、呕吐、持续性疲劳等症状，统称为晕动病[1]。其主要由晕船、晕机、晕车以及视觉诱发所产生[2]。虽然晕动病的发生机制至今没有完全阐明，但已有证据表明，机体暴露于异常加速度环境所引起的应激反应、植物神经系统功能异常是促使晕动病发生发展的重要原因[3]。不少实验证实，现有的多种抗晕动病药物，如东莨菪碱等，可以缓解恶心、呕吐等晕动病主要症状，但对植物神经系统功能异常以及持续性疲劳没有缓解作用[4]。有意义的是，有研究发现提高糖皮质激素信号通路的活性能够增强机体对异常加速度的耐受能力[5]。近期，在人群试验中还发现，与暴露前相比，异常加速度暴露15 min后，其血清胰岛素含量平均下降33%、血糖平均升高24%、血清丙酮酸、β-羟基丁酸分别平均升高309%和201%[6]。此外，笔者通过动物实验结果证实，注射胰岛素或采用特殊营养素增加内源性胰岛素分泌量可明显缓解加速度暴露所致的血糖、血清丙酮酸、β-羟基丁酸的升高幅度，缓解疲劳。在上述研究结果的基础上，本研究组配制了以具有调节糖皮质激素信号通路、活性确切的传统中药——人参的活性成分(Rb1、Rg1)和具有刺激胰岛素分泌功效的营养素(葡萄糖、酪氨酸、亮氨酸)为主要功能成分的营参合剂[7]。本研究拟通过动物实验观察其预防晕动病的效果。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组与处理

雄性SD大鼠(SCXK2013/0016)，购自Sino-British SIPPR/BK实验动物中心，体质量(287±20)g，4只大鼠为1笼，饲养室温度保持(23±2)℃，提供12 h光照、12 h黑夜的变化周期，保持饲养室内干净卫生，提供充足卫生的饮食饮水。适应1周后，按数字表法随机分为对照组、加速度暴露组(暴露组)、加速暴露+东莨菪碱给药组(东莨菪碱组)、加速度暴露+营参合剂干预组(营参合剂组)4个大组，每组32只大鼠。每个大组进一步分为旷场、Morris水迷宫、负重游泳实验和血生化指标检测4个亚组，均设置在暴露后，每个亚组8只大鼠，实验期间无死亡。对照组和暴露组大鼠灌胃生理盐水，东莨菪碱组大鼠灌胃东莨菪碱水溶液，营参合剂组大鼠灌胃营参合剂水溶液，灌胃剂量均为2 ml/只。东莨菪碱水溶液制作方法：蒸馏水稀释东莨菪碱至0.2 mg/ml(购自aladdin公司，批号 H1507073)[12]。营参合剂水溶液制作方法：葡萄糖0.4 g(购自VETEC公司，批号WXBC2393V)，酪蛋白0.3 g(购自MACKLIN公司，批号C10052764)，亮氨酸0.1 g(购自VETEC公司，批号 WXBB1226V)， Rb1 3.3 mg(购自TREBIO公司，批号YT1658978)，Rg1 3.3 mg(购自TREBIO公司，批号YT1687897)，溶于1 ml蒸馏水。灌胃30 min后，除对照组外，其余各组大鼠均进行加速度暴露2 h。暴露结束后即刻，各组大鼠按照计划分别进行旷场、Morris水迷宫和负重游泳实验，生化指标检测亚组大鼠则立刻断头处死，取血清备用。本实验遵循国家卫生研究所实验动物护理使用指南以及实验动物福利指南。

1.2 大鼠加速度暴露方法

加速度暴露装置根据Crampton等[13]报道制成。将大鼠无束缚地放入旋转刺激装置的有机玻璃笼内，绕水平轴顺时针旋转，以16°/s2的角加速度从0加速至120°/s，立即以48°/s2的角加速度减速直至旋转停止。经历1 s暂停后，容器继续以上述方式逆时针方向旋转。如此顺时针-暂停-逆时针循环。1个循环大约持续21 s。

1.3 晕反应指数评分标准

研究证实，异常加速度暴露后大鼠因植物神经系统功能异常而引起排便、排尿增加以及立毛、震颤等症状，其严重程度与大鼠晕动病的严重程度相关，因此研究者提出可采用晕反应指数作为大鼠晕动病严重程度的判断指标[8]。参照文献[8]提供的方法，计数加速度暴露过程大鼠排出的粪便颗粒数，每粒粪便计1分；有排尿则计1.2分，无排尿不计分；若有轻度立毛现象的计0.6分，重度计1.2分；有震颤现象计1.2分。晕反应指数为各项得分的总和。

1.4 血清激素和生化指标检测方法

所有的生化检测均重复2次。

1.4.1 血清激素含量 血清皮质醇、肾上腺素、去甲肾上腺素、胰高血糖素以及血糖水平升高，胰岛素水平降低是机体应激反应的主要表现[9]。通过检测血清中这些激素的水平来观察加速度暴露后大鼠是否处于应激状态，同时观察东莨菪碱和营参合剂对加速度暴露引起的应激反应是否有保护作用。采用放射免疫法 (试剂盒购自北方生物技术研究所)检测大鼠血清胰岛素、胰高血糖素和皮质醇水平，采用酶联免疫吸附 (ELISA) 法(试剂盒购自美国Zymo Research公司)检测大鼠血清肾上腺素、去甲肾上腺素水平。

1.4.2 血清丙酮酸、β-羟基丁酸、血糖水平 前期研究发现人体经历加速度暴露后血清丙酮酸、β-羟基丁酸水平大幅度升高。虽然存在争议，但大多数学者认为体内丙酮酸、β-羟基丁酸蓄积与疲劳发生发展有关[10-11]。采用ELISA法(试剂盒购自南京建成生物科技有限公司)检测大鼠血清丙酮酸、β-羟基丁酸水平。采用罗氏血糖仪检测大鼠血糖值。

1.4.3 三磷酸腺苷(ATP)水平 ATP作为机体直接的能量来源，其浓度直接影响多种人体功能，反映了机体疲劳状态。因此，本研究检测了各组大鼠的海马、前额皮层、肝脏、肌肉组织中ATP水平。采用ATP分析试剂盒(试剂盒购自南通碧云天生物技术公司)检测大鼠ATP水平。

1.5 脑力和体力疲劳评价指标检测方法

用旷场活动距离、水迷宫找平台时间来评价大鼠的脑力疲劳状态[12]，用负重游泳时间来评价大鼠的体力疲劳状态[13]。所有实验均重复3次。

1.5.1 旷场实验 参照文献[14]提供的方法，大鼠放入旷场实验装置(RD1112-IFO-R-4, Mobiledatum, Shanghai, China)，装置使用的是黑色长方体箱(长：40 cm，宽：40 cm，高：90 cm)，将大鼠轻柔地放在敞开的中心区域内。(每次1只)放入后立即盖盖，计算机自动记录大鼠在暗箱中活动情况。使用软件(EthoVision XT 8.5，Noldus，Netherlands)统计每只大鼠5 min内在箱子内活动的总距离(cm)。

1.5.2 Morris水迷宫 参照文献[14]提供的方法，水迷宫直径1.5 m，高0.6 m。注入水深0.4 m，水温23～24 ℃。水池划分为东南、东北、西南和西北4个象限。在1个选定的象限中放入1个直径为10 cm的平台(台面在水面下1 cm)。大鼠有90 s的时间在水中寻找平台，如果在90 s内未能找到，将由实验人员指引至平台并停留30 s。大鼠每日接受3次连续训练。经过训练的各组大鼠在加速度暴露后立即依次分别放入4个象限(时间间隔5 min)寻找到平台。使用软件(EthoVision XT 8.5，Noldus，Netherlands)记录每只大鼠分别从4个象限放入池中找到平台时间，4次的平均值为该大鼠找平台时间(s)。

1.5.3 负重游泳实验 参照文献[15]提供的方法，1 m×0.5 m玻璃箱，水深0.85 m，水温23～24 ℃。大鼠尾巴负重物为其体质量4%。秒表记录从入水到力竭的时间(min)做为大鼠负重游泳能力指标。大鼠超过10 s未能浮出水面呼吸即可判断其为力竭表现。

1.6 统计学处理

实验数据用GraphPad Prism v6.0(GraphPad Prism Inc., La Jolla, CA, USA)软件进行处理，数据以均数±标准差(x±s)表示。各指标组间比较采用独立样本t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠晕反应指数比较

暴露组大鼠的晕反应指数(8.58±2.75)与对照组(1.48±1.43)相比显著升高(P<0.05)；与暴露组相比，东莨菪碱组的晕反应指数(3.35±1.83)和营参合剂组大鼠的晕反应指数(5.55±1.16)上升幅度有不同程度的缓解(P<0.05)。上述结果表明，加速度暴露前服用东莨菪碱和营参合剂均可以明显缓解实验动物的晕动病严重程度，东莨菪碱的效果更优于营参合剂。

2.2 各组大鼠脑力和体力疲劳相关指标比较

与对照组比，暴露组大鼠旷场活动总距离显著缩短(P<0.05)，Morris水迷宫找平台时间显著延长(P<0.05)，负重游泳时间显著缩短(P<0.05)。这表明加速度暴露导致大鼠出现明显的脑力和体力疲劳。与暴露组相比，东莨菪碱组大鼠加速度暴露后的脑力和体力疲劳指标没有明显变化，但营参合剂组大鼠旷场活动总距离显著延长(P<0.05)，水迷宫找平台时间明显缩短(P<0.05)，负重游泳时间明显延长(P<0.05)。这些结果表明提前服用营参合剂能在一定程度上预防加速度暴露大鼠脑力和体力疲劳的发生。见表1。

注：与对照组比aP<0.05；与暴露组比bP<0.05；与东莨菪碱组比cP<0.05

表2 各组大鼠血糖和血清应激激素含量比较(x±s，每组n=8)

注：与对照组比aP<0.05；与暴露组比bP<0.05；与东莨菪碱组比cP<0.05

2.3 各组大鼠血糖和血清激素水平比较

与对照组比，暴露组大鼠血清胰岛素水平降低(P<0.05)，血糖、皮质醇、胰高血糖素、肾上腺素、去甲肾上腺素水平升高(P<0.05)。与暴露组相比，东莨菪碱组大鼠上述血清激素水平没有明显变化，但营参合剂组大鼠血清胰岛素水平明显高于暴露组和东莨菪碱组，血清皮质醇、肾上腺素、去甲肾上腺素和胰高血糖素水平则明显低于暴露组和东莨菪碱组。上述实验结果表明，异常加速度暴露引起实验大鼠出现明显的应激反应，加速度暴露前服用东莨菪碱对加速度暴露大鼠的应激反应没有明显的影响，而加速度暴露前服用营参合剂可以明显缓解加速度暴露大鼠应激反应的强烈程度。见表2。

2.4 各组大鼠血清丙酮酸和β-羟基丁酸水平比较

与对照组比，暴露组大鼠血清丙酮酸水平和β-羟基丁酸水平明显升高(P<0.05)。与暴露组大鼠相比，东莨菪碱组大鼠血清丙酮酸和β-羟基丁酸水平无明显差异(P>0.05)；而与东莨菪碱组和暴露组相比，营参合剂组大鼠血清丙酮酸和β-羟基丁酸水平均明显降低(P<0.05)。由此表明，营参合剂可以减少加速度暴露大鼠血清致疲劳物质的产生。见表3。

表3 各组大鼠血清丙酮酸和β-羟基丁酸水平比较(μmol/ml，x±s，每组n=8)

注：与对照组比aP<0.05；与暴露组比bP<0.05；与东莨菪碱组比cP<0.05

2.5 各组大鼠的海马、前额皮层、肝脏、肌肉组织中ATP水平比较

与对照组相比，暴露组大鼠的4种组织中ATP水平明显下降(P<0.05)。加速度暴露刺激后，东莨菪碱的处理并未发挥作用；而营参合剂能有效地提高加速度暴露刺激后大鼠4种组织中ATP水平(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠海马、前额皮层、肝脏和肌肉组织中ATP水平比较(nmol/mg protein，x±s，每组n=8)

注：与对照组比aP<0.05；与暴露组比bP<0.05；与东莨菪碱组比cP<0.05。ATP为三磷酸腺苷

3 讨论

严重晕动病者可丧失自理能力或作业能力[16]。迄今已研究得到的数十种晕动病防治药物虽然可以不同程度地减轻晕动病恶心、呕吐等症状，但对晕动病疲劳症状均无明显疗效，还存在嗜睡等不良反应，严重限制了其在航海、航空等作业领域的应用[17]。本研究结果再次证实，经典的抗晕动病药物东莨菪碱可以缓解加速度暴露大鼠晕反应指数的升高幅度，但对加速度暴露引起的脑力和体力疲劳没有明显影响。因此，研制一种能够抗疲劳且无嗜睡等不良反应的抗晕动病药物十分必要。

晕动病的发生与机体应激反应有关，而具有高基础活性糖皮质激素系统的个体对异常加速度环境有较高的耐受能力[4]。另外，有研究者发现血糖的异常升高可刺激下丘脑呕吐中枢引发呕吐[6]。本研究组在动物实验及人体试验中先后发现，加速度暴露机体发生应激反应，血清胰岛素水平下降、血糖升高，其在晕动病发生发展过程中起重要作用。有意义的是，本研究通过动物实验初步证实，提前服用以具有增强皮质醇与其受体结合活性功效的中药人参活性成分(Rb1、Rg1)和具有刺激胰岛素分泌作用的营养素(葡萄糖、酪氨酸、亮氨酸)为主要成分的营参合剂不但可以一定程度地降低异常加速度暴露大鼠的晕反应指数，而且可以明显缓解加速度暴露引起的脑力和体力疲劳。上述结果表明，营参合剂具有一定的晕动病预防功效，而且其作用环节与东莨菪碱的作用环节不同，因此可以缓解加速度暴露引起的脑力和体力疲劳，并没有嗜睡等不良反应。

血清胰岛素水平降低可以影响机体的能量代谢进而导致血清丙酮酸、β-羟基丁酸水平上升，而后者与疲劳的发生发展有关。本研究结果显示，与暴露组大鼠相比，东莨菪碱组大鼠血清激素和血清丙酮酸、β-羟基丁酸等致疲劳物质水平没有明显变化；但营参合剂组大鼠血清皮质醇、肾上腺素和去甲肾上腺素水平明显降低，血清胰岛素水平明显升高，血糖和血清丙酮酸、β-羟基丁酸水平均明显降低。除此之外，研究发现营参合剂还能有效提高加速度暴露大鼠4种组织中ATP水平。这些结果提示，营参合剂预防晕动病作用可能与其能够提高机体对异常加速度刺激的耐受能力，促进胰岛素的分泌进而降低血清丙酮酸、β-羟基丁酸等致疲劳物质水平有关，确切的机制尚有待进一步研究。