冬眠合剂对猪精液常温和低温保存的影响

王双慧，葛丽蓉，陈佳明，丁皇宇，陈忠法，王 伟

（浙江万里学院生物与环境学院，浙江省生物工程一流学科实验室，浙江宁波 315100）

随着我国养猪业的集约化和科技化发展，人工授精技术在现代养猪业中受到越来越多的关注。人工授精技术的应用可以有效降低生产成本，并加快优良基因推广。目前猪精液普遍在15～20℃进行液态保存[1]，最常用的保存温度为16.5～17℃，低于此温度会严重影响猪精子的存活率[2]。猪精子对低温的应激非常敏感[3]，但温度太高又会导致精液的保存时间缩短。因此，研制出适合猪精子低温保存的稀释液，是解决猪精液液态保存的关键[4]。

人工冬眠可降低机体对各种病理刺激的反应[5-6]。鉴于猪精子对环境温度的高敏感性，本实验拟以冬眠合剂（主要成分为氯丙嗪和异丙嗪）为基础，配制猪精液的常温和低温稀释液，以诱导细胞休眠的方式来延长猪精液的保存时间，为猪精液保存提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料 猪精液从浙江爱卡畜牧有限公司购买，采精后经过预稀释，并于2 h 内送到实验室。以存活率＞90% 的精液为合格，精液保存的密度范围在1.2×108～1.5×108。本实验中精液的稀释、分装和保存过程均为无菌操作。

本实验用到的化学试剂均为国产AR 级别，无菌耗材购买自BBI 公司。配制冬眠合剂用的氯丙嗪和异丙嗪购买自TCI 公司，青霉素/链霉素双抗购买自碧云天生物技术研究所，吉姆萨染液购买自Solarbio 公司，用到的显微成像系统为Leica DM2500 系统。

1.2 实验方法

1.2.1 冬眠合剂对常规保存温度下精液保存的影响 冬眠合剂的配方：准确称取氯丙嗪0.1 g 和异丙嗪0.1 g，在50 mL PBS 中混合均匀后，用0.22 μm 滤器除菌待用。Modena 常温稀释液的配方为（1 L）[7-8]：葡萄糖27.5 g、柠檬酸钠1.0 g、EDTA-Na22.35 g、碳酸氢钠1.0 g、Tris 5.65 g、柠檬酸2.9 g。用0.22 μm 的滤器进行过滤除菌，冷冻保存，使用时4℃解冻后再添加双抗。在15℃条件下，Modena 常温稀释液中按0、1/10、1/20、1/40、1/80 和1/160 添加冬眠合剂，通过测定精子活率筛选出冬眠合剂的最佳添加浓度。然后在17、14、12、10℃下，研究冬眠合剂对猪精液保存的影响。对照为添加PBS 溶液的Modena 常温稀释液。在处理后的1、3、5、7 d，实验结束时进行精子涂片，吉姆萨染色观察精子的形态学变化，采用组织学方法对精子的顶体、头部及颈部的形态学进行分析。精子活率的测定参考陈军的方法[9]进行。

1.2.2 冬眠合剂对低温条件下精液保存的影响 低温保存稀释液的配方（1 L）[7-8]：葡萄糖30.0 g、蔗糖40.0 g、青霉素0.6 g、离心后备用的卵黄20 mL。先用棉花蘸取无水乙醇将整个鸡蛋外壳进行全面消毒，然后用镊子柄部轻轻敲打鸡蛋稍尖一头，用镊子将鸡蛋壳小心取出，仅露一个小洞，将鸡蛋翻转，让蛋清自然流出，流出大部分后继续去除蛋壳，将剩余的蛋黄和少量蛋清倒于事先准备好的滤纸上，轻轻摇晃滤纸，让卵黄和蛋清分离，最后用一次性注射器（去除针头）插入整个完整的卵黄中吸取卵黄，不要吸取卵黄膜。将卵黄与水按比例配制成20% 的卵黄液，离心取上清液备用。以低温保存稀释液为基础，在10、8、6、4℃条件下，研究冬眠合剂对猪精液保存的影响。冬眠合剂配方和添加比例同1.2.1。

1.3 统计分析 所有数据用平均值±标准差来表示，且所有实验均重复3 次。实验数据采用 SPSS 17.0 统计软件进行处理，经单因素方差分析（ANOVA），差异显著性检验采用Turkey 检验法进行多重比较，P＜0.05 表示差异显著，P＞0.05 表示差异不显著。

2 结果

2.1 常温稀释液中添加冬眠合剂对精子活率的影响 如图1 所示，在常温稀释液中添加冬眠合剂，在15℃条件下保存7 d，1/40 的添加比例效果最好，而1/10 的添加比例效果最差。精液在保存5 d 后，活率迅速降低，在保存7 d 后对照组活率为零。因此，选择冬眠合剂的添加量为1/40，保存时间为7 d。

如图2 所示，在17、14、12、10℃ 4 个温度条件下分别添加冬眠合剂，17℃效果最好，添加冬眠合剂3 d后精子活率显著高于对照组，且保存7 d 后精子活率还有40%以上。而12℃和10℃保存条件下，冬眠合剂组和对照组保存效果差异均不显著。

2.2 低温稀释液中添加冬眠合剂对精子活率的影响 如图3 所示，在低温稀释液中添加冬眠合剂，在8℃条件下保存7 d，1/40 的添加比例效果最好，而1/10 的添加比例效果最差。从第3 天开始1/10 组保存的精子活率为0，第7 天时1/20 组的精子活率为0。因此，选择冬眠合剂的添加量为1/40。

如图4 所示，在10、8、6、4℃ 4 个温度条件下分别添加冬眠合剂，8℃效果最好，保存9 d 后，精子活率高于60%；保存14 d 后，精子活率仍高于25%。添加冬眠合剂7 d 后，10、8、6℃精子活率显著高于对照组。而4℃保存条件下，对照组在5 d 时精子活率为0。

2.3 稀释液中添加冬眠合剂对猪精子形态学的影响 本实验保存后的精子完整性很好，头部形状规则、染色均匀。进一步研究精子的状态发现，在常规保存温度（17℃）条件下保存7 d 后，PBS 对照组精子常趋向于聚集状态（图5-A），且稀释液中的细胞碎片很多；冬眠合剂实验组精子也趋向于聚集的状态，但是稀释液中的细胞碎片并不明显（图5-B）。而低温条件下（8℃）保存14 d 后，PBS 对照组和冬眠合剂组的精子均呈均匀分布，且稀释液中的细胞碎片很少（图5-C，5-D）。

3 讨 论

本实验通过在猪精液稀释液中添加冬眠合剂（氯丙嗪和异丙嗪）显著提高了保存精子活率，并显著延长了精液的保存时间；经过筛选，常温保存条件下17℃为最佳保存温度，冬眠合剂添加比为1/40；低温保存条件下8℃为最佳保存温度，冬眠合剂添加比为1/40；其中效果最好的是8℃低温稀释液，添加冬眠合剂保存9 d后，精子活率可以达到60%。此外，本实验通过形态学分析发现，添加冬眠合剂可以明显降低稀释液中的精子碎片，有利于保持精子形态学的完整性。经比较，常温17℃下保存的稀释液中添加冬眠合剂对猪精液保存时间效果优于稀释液中添加维生素类对猪精子保存的结果[10]，其效果也优于曲酸[11]和原花青素[12]对猪精液保存时间的影响结果；而低温稀释液中添加冬眠合剂对延长猪精液保存时间效果高于茶多酚[13]和大豆卵磷脂[14]对猪精液低温保存的影响，以及稀释剂中添加蔗糖和乳糖的结果[15]。

抗氧化剂能有效促进猪精液的体外保存效果[16]。本实验用到的冬眠合剂成分为氯丙嗪和异丙嗪，皆属于吩噻嗪类药物。由于吩噻嗪母核极易被氧化，表现出很强的细胞抗氧化能力[17]。因此氯丙嗪和异丙嗪可以降低精子的过氧化损伤，从而增加精子保存的时间和存活率。已有研究表明，氯丙嗪和异丙嗪通过改变葡萄糖代谢[18]和抑制葡萄糖摄取[19]来抑制神经细胞被氧化。推测在猪精液保存过程中，氯丙嗪和异丙嗪也发挥了类似的作用。

钙离子在精子运动中起着重要作用，精子的运动在某些特征上类似于平滑肌。氯丙嗪是钙调蛋白抑制剂，可降低精子对钙离子的反应，从而抑制精子的运动[20]。当猪精子处于一种“冷休克”状态时，可有效缓解精子对能量的消耗[4]。有研究发现，抗坏血酸和氯丙嗪混合使用可改善杂交公牛解冻后精液质量[21]。此外，吩噻嗪类药物还具有抑制细胞凋亡[22]和抗菌的效果[23]，因此表现出更有利于精子保存的效果。

综上所述，冬眠合剂（氯丙嗪和异丙嗪）的添加有助于提高精子的抗氧化能力和抑制精子的运动，从而延长猪精液的低温和常温的保存时间。可以此为基础，开发出新型的猪精液稀释液。