香炉山鸡隐性白羽鉴定分析

2020-03-08李兴才潘成勇杨华婷

中国畜牧杂志 2020年2期

李兴才，潘成勇，李辉*，杨华婷，陈林

（1.贵州大学动物科学学院，高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州贵阳 550025；2.贵州大学贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵州贵阳 550025；3.凯里凤凰苑畜牧养殖有限公司，贵州凯里 556000）

鸡的羽毛颜色受多个等位基因控制，目前已经发现存在5 对等位基因，分别为抑制色素形成基因I、色素原基因C、氧化酶基因O、抑制色素表现基因P以及非白化基因A，其中只有I基因和C基因已分别被定位于PMEL17与TYR基因上，其他基因未见报道[1]。I基因存在时，无论其他基因是否显隐性都表现为白羽型，因此通常被称为显性白羽；隐性白羽情况比较复杂，但目前为止对于C基因控制的白羽研究比较多，因此由C基因控制的白羽通常称为隐性白羽。Kerje 等[2]研究发现，PMEL17基因第十外显子区域插入了一段9 bp 的核苷酸序列导致黑色素基因非正常转录翻译，引起显性白羽产生。Chang 等[3]研究得出TYR（络氨酸酶基因）第四内含子区域插入了一段长7.7 kp 的内源性白血病病毒ALV 序列，导致TYR基因转录物中缺少第五外显子编码的跨膜结构域而无法正常转录，从而使络氨酸酶失去正常功能活性，致使黑色素无法合成，导致隐性白羽形成。中国消费者对鸡羽毛颜色具有一定偏好，认为白色是一种不吉利的颜色，因此本研究对鸡群白羽与有色羽鉴定具有一定的研究价值。

香炉山鸡系贵州省凯里地区苗族人民从中原迁徙到西南后，在香炉山区域长期封闭的自然条件下形成的原始类群，主要分布于贵州省黔东南凯里、麻江、黄平、丹寨等县。香炉山鸡体型矮小、结实紧凑、结构匀称，具有耐粗饲、抗逆性强、无应激、抗病能力强、营养丰富、肉质鲜美等特点[4-5]。在香炉山鸡群体中，有千分之二左右的白羽鸡出现，经研究分析为隐性白羽等位基因造成，其中杂合子个体表型与显性纯合子表现一致，但部分杂合子鸡群翅膀和尾部羽毛出现白斑现象，因此凯里凤凰苑畜牧养殖有限公司计划在香炉山鸡选育中剔除杂合子个体，建立麻羽和白羽2 个品系。采用传统选育一般要连续几个世代才能淘汰杂合子鸡群，耗时耗力，本研究利用分子辅助标记技术对香炉山鸡隐性白羽进行鉴定，成本低廉、准确度高，只需一代就能淘汰全部杂合子，能够有效缩短育种周期，加快育种进展。本研究将为香炉山鸡种质资源保护、开发与利用奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物本实验选用的香炉山鸡来自贵州省黔东南州凯里市凤凰苑畜禽养殖有限公司种鸡扩繁场，其中有色羽60 只、白羽60 只，公母各半。使用EDTA 抗凝管翅静脉采血，采血过程中快速颠倒混匀，置于低温泡沫盒内带回实验室，-20℃保存用于总DNA 提取。

1.2 基因组DNA 提取利用血液基因组DNA 提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）对香炉山鸡基因组DNA 进行提取，紫外分光光度计检测其浓度，OD 值在1.8～2.0 为合格。利用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，合格DNA 样品分装于-20℃冰柜保存备用。

1.3 引物设计及PCR 扩增根据GenBank 发布的TYR基因第四内含子序列含ALV 插入序列结合TYR第四内含子未含插入序列作为参考，利用引物设计软件Primer 5.0 和Oligo 6.0 进行多重PCR 引物设计。NCBI上参考序列GenBank 登录号分别为DQ118701.1 和DQ118702.1。引物设计特点是共用同一条上游引物，总共2 对3 条引物，分别命名为F、R1、R2。引物F：5'-GGGAAACTTTAAGGACTGGTGGA-3'，R1：5'-CTG GGTAGATGGACAGACCGTTG-3'，R2：5'-CAAGAGG CACAAGGAGTGGGACA-3'，序列送往上海英潍捷基生物有限公司进行引物合成。

PCR 扩增运用15 μL 反应体系：1 个上游和2 个下游引物（10 pmol/μL）各1 μL，（80 ng/μL）模板DNA 1 μL，2×Es Taq Master Mix 7 μL，ddH2O 4 μL。反应条件为：95 ℃预变性5 min；95℃变性45 s、59.2℃退火45 s、72℃延伸40 s，35 个循环；72℃终延伸8 min，4℃保存。

1.4 统计分析将香炉山鸡隐性白羽基因PCR 扩增产物用1.0% 的琼脂糖凝胶、130 V 电泳30min 进行检测，用凝胶成像系统对检测结果进行拍照读取。根据鉴定结果挑选2 种纯合子PCR 产物送往北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序验证，应用Popgene2.1 软件对香炉山鸡鉴定结果进行平均等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Shanon 指数、多态信息含量（PIC）、等位基因频率、基因型频率等计算。

2 结果

2.1 隐性白羽C 基因鉴定分析本研究提取的DNA 经琼脂糖凝胶电泳检测条带清晰明亮，无严重拖带，说明提取效果较好，可以用于后续实验。实验利用2 对3 条F、R1、R2 引物对120 只香炉山鸡隐性白羽基因型进行双重PCR 鉴定分析。结果显示PCR 扩增产物在1.0% 的琼脂糖凝胶电泳检测中产生3 种类型的条带，其中只能够得出169 bp 条带的待测鸡等位基因型为cc 的隐性白羽纯合型，只得出526 bp 条带的待测鸡等位基因型为CC 的有色羽纯合型；如果同时得出169 bp 和526 bp 2条带的待测鸡等位基因型为Cc 的有色杂合型，凝胶电泳检测结果如图1～5 所示。统计得出CC 型为56 个，占总群体46.67%；Cc 型为4 个，占3.33%；cc 为60 个，占50%。能够成功鉴定出隐性白羽cc 型与尾部白斑杂合子Cc 型，为香炉山鸡剔除杂合子建立2 个纯合子鸡群提供理论依据。鉴定出60 只白羽鸡群全部为隐性纯合，60 只有色羽样品未出现隐性白羽纯合基因型，与表现型结果一致，说明鉴定结果准确可靠。

利用Popgene 2.1 软件对隐性白羽C 基因多态性分析得出Na 为2、Ne 为1.997 8，如表1 所示。Shannon指数为0.692 6、PIC 为0.374 7，0.25＜PIC＜0.50，该位点为中度多态，Shannon 指数与PIC 具有一致性，说明香炉山鸡隐性白羽基因多态性比较丰富，具有一定的选育空间。

3 讨论

鸡的羽毛颜色性状是消费者比较关心的质量性状。羽毛颜色种类繁多，主要分为有色羽和白羽两类。羽色形成过程比较复杂，受多种色素原基因控制[6]，正是这样形成了各具特色的地方品种资源。在香炉山鸡选育中发现隐性白羽的存在，鸡群白羽基因杂合子中部分出现翅膀和尾部白斑现象，为更好地保护、开发、利用这一类群，本研究采用分子辅助标记选育方法，利用多重PCR 结合琼脂糖凝胶电泳技术，快速鉴定分离淘汰杂合子。相对于传统的选育方式，该方法成本低廉、准确度高、省时省力，同时具备有效缩短育种周期、加快育种进展等优点，有利于香炉山鸡2 个核心群快速建立，防止优良的地方种质资源流失。

隐性白羽主要是色素原基因C起主导作用，它被定位于TYR基因上。TYR是一种含铜的金属酶，是黑色素形成的关键酶[7]，而黑色素是否表达与隐性白羽的形成密切相关。研究证明TYR基因第四内含子区域插入内源性白血病病毒ALV 序列，导致隐性白羽形成[8]。因此，本研究利用TYR基因的这一特性，合理地设计出鉴定隐形白羽的双重PCR 引物，成功鉴定分离香炉山鸡隐性白羽，同时成功淘汰该类群隐性白羽杂合子，建立麻羽与隐性白羽2 个纯合群体。

表1 香炉山鸡隐性白羽基因位点多态性

隐性白羽纯合鸡具有体格健壮、性情温顺、繁殖性能好等特点[9]，用于其他品种的改良可以对繁殖性能、生长性能等方面进行改进，由于白羽对其他羽色为隐性的缘故，因此不会大面积改变改良品种羽毛颜色，只是翅膀与尾部出现部分白斑，因而能够最大程度保持原品种性状特征[10-13]，因此可以尝试将隐性白羽鸡群作为其他品种的改良材料。