以柚皮素为结构骨架的拓扑异构酶抑制剂的设计与合成

朱学君， 吕中建， 张孝琴， 张 春， 郭建敏*

（1.西南医科大学 药学院，四川 泸州646000； 2.成都克莱蒙医药科技有限公司，四川 成都610041；3.西南医科大学 基础医学院，四川 泸州646000）

柚皮素是一类天然的黄酮类化合物，广泛存在于天然植物中［1］，且具有重要的生物活性.国内外药理研究表明，柚皮素具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、镇咳、预防动脉粥样硬化、调节免疫等多种药理活性［2-4］.虽然柚皮素的药理活性丰富，但由于其水溶性和脂溶性均较差，生物利用度不高，限制了其临床应用［5］.通过对其结构修饰引入脂溶性或水溶性较强的基团，可提高其脂溶性或水溶性，从而提高生物利用度.文献报道常见结构修饰包括：羟基的烷基化［6］，7 -酮基的胺化［7］、酰化、磺化及苷化，形成金属配合物［5］.

研究发现，拓扑异构酶与正常细胞不同，在肿瘤细胞中表现出不受其他因素影响的高水平表达，因此，拓扑异构酶的活性就能抑制DNA 中肿瘤细胞快速增殖，使拓扑异构酶成为当今抗肿瘤药物的一个重要靶标［8］.本文合成的化合物2 和3［9］是正在临床试验中的拓扑异构酶抑制剂，优点是结构稳定、活性高、较小生物耐药性［9］.在2 个化合物中，吗啉和咪唑环是抑制拓扑异构酶的关键药效基团.本实验结合这2 个活性部位，对柚皮素这一天然产物为骨架进行结构修饰，增加生物利用度，以期开发出活性更高，更具有临床应用价值的药物.本文方法是根据柚皮素母环具有芳香环结构，与拓扑异构酶相互结合并发挥抑制作用，又具有潜在的抗拓扑异构酶活性，而且黄酮类化合物的低毒性也有利于成药，另外，引入不同长度的碳链，以期筛选出一系列高活性化合物（图1）.

1 实验部分

1.1 仪器和试剂所有反应用溶剂均用分子筛（40 nm）干燥后使用.柚皮素购于荷兰BV公司，薄层色谱采用默克薄层色谱硅胶60 F254.核磁仪采用AV-400（400 Hz）或者AV-500（500 Hz）（德国布鲁克公司）.氢谱碳谱的信号峰归属均由二维图谱确定（H-COSY和C -HSQC），高分辨质谱采用正离子法在质谱联用LTQ轨道阱上测定.其他常规试剂购于市面均直接使用，无需进一步处理.

1.2 中间体4 ～7 的合成向圆低烧瓶中加入200 mg（0.75 mmol）柚皮素，4 mL 干燥乙腈，12 mg（0.075 mmol）KI（碘化钾）和0.51 mL（3.00 mmol）DIPEA（二异丙基乙胺）.氮气保护下加入（3.00 mmol）二溴化合物.加热回流过夜.冷却至室温，减压旋干后向剩余物中加入CH2Cl2（二氯甲烷）和水萃取.分出有机层，水层用CH2Cl2洗涤两遍，合并有机层，无水硫酸钠干燥.过滤，减压旋干后经硅胶柱层析分离（洗脱剂：CH2Cl2/EA=100∶ 0）得化合物4 ～6 和（洗脱剂：CH2Cl2/EA =100∶ 5）化合物7（图2）.

图1 柚皮素1，拓扑异构酶抑制剂2、3 和柚皮素系列化合物Fig.1 Naringenin 1，anti-topoisomerase agents 2，3 and series synthesis of naringenin

图2 中间体4 ～7 和终产物8 ～15 合成路线Fig.2 Synthetic route of intermediates 4 to 7 and final product 8 to 15

7 -氧-（3 -溴丙烷基）-柚皮素（化合物4）162 mg黄色油状物，产率55%.核磁数据表征：1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 12.01（s，1H，OH），7.32（d，J=8.4 Hz，2H，Ar），6.89（d，J=8.4 Hz，2H），6.07 ～6.04（m，2H，Ar），5.56（br，1H，OH），5.37 ～5.33（m，1H，CH），4.11（t，J =5.6 Hz，2H，CH2），3.56（t，J =6.4 Hz，2H，CH2），3.09（dd，J =17.2，13.0 Hz，1H，3 -CH2），2.79（dd，J =17.2，3.0 Hz，1H，3 -CH2），2.31（q，J =6.0 Hz，2H，CH2）；13C NMR（101 MHz，CDCl3）δ 196.33（CO），167.19，164.18，163.08，156.37，130.50，128.10，115.83，103.36，95.74，94.72（Ar），79.11（CH），65.90，43.25，31.98，29.67（CH2）.HRMS（ESI）：（M+H ）+计算相对分子质量393.025 9，实测相对分子质量393.026 9.

7 -氧-（4 -溴丁烷基）-柚皮素（化合物5）205 mg黄色油状物，产率67%.核磁数据表征：1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ 12.01（s，1H，OH），7.30（d，J=8.0 Hz，2H，Ar），6.88（d，J =8.1 Hz，2H，Ar），6.38（br，1H，OH），6.10 ～5.94（m，2H，Ar），5.33（dd，J=13.0，2.9 Hz，1H，CH），3.99（t，J=6.0 Hz，2H，CH2），3.46（t，J=6.5 Hz，2H，CH2），3.08（dd，J= 17.2，13.0 Hz，1H，3 - CH2），2.77（dd，J =17.2，3.0 Hz，1H，3 -CH2），2.03 ～1.89（m，4H，CH2）；13C NMR（126 MHz，CDCl3）δ 196.35（CO），167.40，164.14，163.07，156.65，130.22，128.05，115.82，103.23，95.62，94.70（Ar），79.10（CH），67.51，43.19，33.30，29.33，27.65（CH2）.HRMS（M +H）+计算相对分子质量407.041 6，实测相对分子质量407.041 3.

7 -氧-（5 -溴戊烷基）-柚皮素（化合物6）233 mg黄色油状物，产率74%.核磁数据表征：1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 12.01（s，1H，OH），7.44 ～7.29（m，2H，Ar），7.00 ～6.74（m，2H，Ar），6.16 ～5.92（m，2H，Ar），5.50 ～5.32（m，2H，OH，CH），3.97（t，J=6.4 Hz，2H，CH2），3.43（t，J =6.7 Hz，2H，CH2），3.09（dd，J =17.1，13.0 Hz，1H，3 -CH2），2.78（dd，J =17.2，3.0 Hz，1H，3 -CH2），1.99 ～1.55（m，6H，CH2）；13C NMR（101 MHz，CDCl3）δ 196.19（CO），167.54，164.21，163.03，156.32，130.63，128.10，115.81，103.22，95.66，94.73（Ar），79.08（CH），68.25，43.30，33.60，32.47，28.21，24.81（CH2）.HRMS（ESI）：计 算 相 对 分 子 质 量421.057 2，实测相对分子质量421.058 0.

7-4′-氧-二（4 -溴丁烷基）-柚皮素（化合物7）64 mg 黄色油状物，产率16%.核磁数据表征：1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ 12.02（s，1H，OH），7.36（d，J=8.7 Hz，2H，Ar），6.93（d，J =8.7 Hz，2H，Ar），6.05 ～5.98（m，2H，Ar），5.34（dd，J =13.0，3.0 Hz，1H，CH），4.02 ～3.97（m，4H，CH2），3.58 ～3.41（m，4H，CH2），3.07（dd，J =17.1，13.0 Hz，1H，3 ～CH2），2.77（dd，J =17.1，3.0 Hz，1H，3 -CH2），2.17 ～1.86（m，8H，CH2）；13C NMR（126 MHz，CDCl3）δ 196.04（CO），167.23，164.16，162.95，159.37，130.52，127.81，114.79，103.20，95.54，94.60（Ar），79.01（CH），67.45，67.04，43.21，33.50，33.29，29.50，29.32，27.91，27.64（CH2）.HRMS（ESI）：计算相对分子质量541.014 7，实测相对分子质量541.015 9.

1.3 终产物8 ～10 和14 的合成及表征向圆低烧瓶中加入相应（0.25 mmol）溴化物，2.5 mL干燥乙腈，45 mg（0.32 mmol）K2CO3和4.2 mg（0.025 mmol）KI.氮气保护下加入28 μL（0.325 mmol）吗啉，加热回流过夜，冷却至室温，减压旋干后向剩余物中加入CH2Cl2和水萃取.分出有机层，水层用CH2Cl2洗涤两遍，合并有机层，无水硫酸钠干燥.过滤，减压旋干后经硅胶柱层析（洗脱剂：CH2Cl2/MeOH=100∶ 0 ～100∶ 5）分离得化合物8 ～10.化合物14 合成方法与8 ～10 基本相同，而K2CO3和吗啉的投料量为138 mg（1.00 mmol）和86 μL（1.00 mmol）.

7 -氧-（3 -（N-吗啉基）-丙烷基）-柚皮素（化合物8）61 mg黄色油状物，产率61%.核磁数据表征：1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 12.01（s，1H，OH），7.35 ～7.23（m，2H，Ar），6.89 ～6.77（m，2H，Ar），6.02（dd，J =15.4，2.3 Hz，2H，Ar），5.32（dd，J=13.0，3.0 Hz，1H，CH），4.01（t，J =6.2 Hz，2H，CH2），3.75（t，J =4.7 Hz，4H，CH2），3.08（dd，J =17.2，13.0 Hz，1H，3 - CH2），2.76（dd，J =17.2，3.0 Hz，1H，3 -CH2），2.59 ～2.45（m，6H，CH2），2.04 ～1.92（m，2H，CH2）；13C NMR（101 MHz，CDCl3）δ 196.28（CO），167.42，164.16，163.05，156.86，130.06，128.08，115.91，103.22，95.66，94.69（Ar），79.13（CH），66.80，66.59，55.41，53.70，43.22，25.96（CH2）.HRMS（ESI）：计算相对分子质量400.168 2，实测相对分子质量400.169 0.

7 -氧-（4 -（N-吗啉基）-丁烷基）-柚皮素（化合物9）35 mg黄色油状物，产率34%.核磁数据表征：1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 11.94（s，1H，OH），7.25 ～7.16（m，2H，Ar），6.81 ～6.68（m，2H，Ar），5.91（dd，J=20.6，2.3 Hz，2H，Ar），5.22（dd，J=13.0，2.9 Hz，1H，CH），3.87（t，J =6.2 Hz，2H，CH2），3.69（t，J =4.6 Hz，4H，CH2），2.98（dd，J =17.2，13.0 Hz，1H，3 -CH2），2.66（dd，J =17.2，3.0 Hz，1H，3 -CH2），2.55 ～2.32（m，6H，CH2），1.77 ～1.53（m，4H，CH2）；13C NMR（101 MHz，CDCl3）δ 196.29（CO），167.42，164.09，163.03，157.10，129.74，128.09，115.95，103.13，95.57，94.62（Ar），79.12（CH），68.12，66.62，58.59，53.61，43.10，26.86，22.70（CH2）.HRMS（ESI）：C23H28NO6+（M + H）+计算相对分子质量414.183 8，实测相对分子质量414.185 1.

7 -氧-（5 -（N-吗啉基）-戊烷基）-柚皮素（化合物10）50 mg黄色油状物，产率47%.核磁数据表征：1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 12.01（s，1H，OH），7.36 ～7.21（m，2H，Ar），6.82（d，J =8.5 Hz，2H，Ar），6.00（dd，J =17.7，2.3 Hz，2H，Ar），5.30（dd，J=13.1，2.9 Hz，1H，Ar），3.92（t，J =6.4 Hz，2H，CH2），3.76（t，J=4.7 Hz，4H，CH2），3.07（dd，J= 17.2，13.1 Hz，1H，3 - CH2），2.75（dd，J =17.2，3.1 Hz，1H，3 -CH2），2.61 ～2.35（m，5H），1.86 ～1.68（m，2H，CH2），1.66 ～1.51（m，2H），1.51 ～1.36（m，2H，CH2）；13C NMR（101 MHz，CDCl3）δ 196.27（CO），167.54，164.13，163.04，157.10，129.83，128.11，115.97，103.13，95.59，94.65（Ar），79.14（CH），68.29，66.67，59.00，53.70，43.16，28.79，25.87，23.95（CH2）.HRMS（ESI）：计算相对分子质量428.199 5，实测相对分子质量428.199 1.

7，4′-氧-二-（4 -（N -吗啉基）-丁烷基）-柚皮素（化合物14）89 mg 黄色油状物，产率64%.核磁数据表征：1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ 12.02（s，1H，OH），7.36（d，J =8.5 Hz，2H，Ar），6.93（d，J=8.5 Hz，2H，Ar），6.09 ～5.99（m，2H，Ar），5.35（dd，J=13.0，2.9 Hz，1H，CH），4.00（dt，J =7.7，6.3 Hz，4H，CH2），3.72（q，J =5.1 Hz，8H，CH2），3.09（ddd，J =17.1，13.0，1.1 Hz，1H，3 - CH2），2.85 ～2.72（m，1H，3 -CH2），2.55 ～2.30（m，12H，CH2），1.81（tt，J=13.9，6.7 Hz，4H，CH2），1.75 ～1.54（m，4H，CH2）.13C NMR（126 MHz，CDCl3）δ 196.04（CO），167.47，164.17，162.96，159.55，130.37，127.79，114.82，103.13，95.57，94.63（Ar），79.06（CH），68.26，67.85，67.03，58.66，58.51，53.79，53.78，43.24，27.21，26.89，23.13，22.96（CH2）.HRMS（ESI）：（M +H）+计算相对分子质量555.299 2，实测相对分子质量555.299 9.

1.4 终产物11 ～13 和15 的合成及表征向圆低烧瓶中加入相应（0.25 mmol）溴化物，2.5 mL干燥乙腈，17 mg（0.125mmol）K2CO3和34 mg（0.50 mmol）咪唑.氮气保护下加热回流过夜.冷却至室温，减压旋干后向剩余物中加入CH2Cl2和水萃取.分出有机层，水层用CH2Cl2洗涤两遍，合并有机层，无水硫酸钠干燥.过滤，减压旋干后经硅胶柱层析（洗脱剂：CH2Cl2/MeOH =100∶ 0 ～100∶ 5）分离得化合物11 ～13.化合物15 合成方法与11 ～13基本相同，而K2CO3和咪唑的投料量为34.5 mg（0.25 mmol）和68 mg（1.00 mmol）（图2）.

7 -氧-（3 -（N-咪唑基）-丙烷基）-柚皮素（化合物11）40 mg黄色油状物，产率42%.核磁数据表征：1H NMR（500 MHz，DMSO -d6）δ 12.10（s，1H，OH），9.67（s，1H，OH），7.61（d，J =1.2 Hz，1H，Ar），7.32（d，J =8.6 Hz，2H，Ar），7.17（d，J =1.2 Hz，1H，Ar），6.89（d，J =1.1 Hz，1H，Ar），6.80（d，J=8.5 Hz，2H，Ar），6.15 ～6.01（m，2H，Ar），5.48（dd，J =12.9，2.9 Hz，1H，CH），4.10（t，J =6.9 Hz，2H，CH2），3.94（td，J =6.2，1.7 Hz，2H，CH2），3.32（dd，J =17.1，13.0 Hz，1H，3 -CH2），2.72（dd，J=17.2，3.0 Hz，1H，3 -CH2），2.13（t，J=6.5 Hz，2H，CH2）.13C NMR（126 MHz，DMSO）δ 197.01（CO），166.52，163.19，162.91，157.82，137.39，128.70，128.47，128.42，119.40，115.21，102.72，95.10，94.15（Ar），78.66（CH），65.31，42.79，42.04，29.86（CH2）.HRMS（ESI）（M+H）+计算相对分子质量381.137 2，实测相对分子质量381.136 5.

7 -氧-（4 -（N-咪唑基）-丁烷基）-柚皮素（化合物12）56 mg黄色油状物，产率57%.核磁数据表征：1H NMR（500 MHz，DMSO -d6）δ 12.10（s，1H，OH），9.63（s，1H，OH），7.63（d，J =1.1 Hz，1H，Ar），7.37 ～7.28（m，2H，Ar），7.17（t，J =1.2 Hz，1H，Ar），6.88（t，J =1.0 Hz，1H，Ar），6.82 ～6.76（m，2H，Ar），6.13 ～6.01（m，2H，Ar），5.48（dd，J=12.9，2.9 Hz，1H，CH），4.01（dt，J =9.3，6.6 Hz，4H，CH2），3.31（dd，J=17.2，12.8 Hz，1H，3 - CH2），2.72（dd，J = 17.2，3.0 Hz，1H，3 -CH2），1.88 ～1.75（m，2H，CH2），1.61（dt，J =9.3，6.5 Hz，2H，CH2）；13C NMR（126 MHz，DMSO）δ 196.96（CO），166.72，163.20，162.89，157.79，137.25，128.71，128.41，128.37，119.28，115.19，102.59，95.05，94.16（Ar），78.62（CH），67.70，45.52，42.02，27.18，25.43（CH2）.HRMS（ESI）：（M + H）+计算相对分子质量395.152 9，实测相对分子质量395.151 6.

7 -氧-（5 -（N-咪唑基）-戊烷基）-柚皮素（化合物13）41 mg黄色油状物，产率40%.核磁数据表征：1H NMR（500 MHz，DMSO -d6）δ 12.11（s，1H，OH），9.69（s，1H，OH），7.62（s，1H，Ar），7.37～7.27（m，2H，Ar），7.15（d，J =1.3 Hz，1H，Ar），6.88（d，J =1.4 Hz，1H，Ar），6.84 ～6.75（m，2H，Ar），6.10 ～6.02（m，2H，Ar），5.46（dd，J =12.9，3.0 Hz，1H，CH），3.97（dt，J =21.2，6.8 Hz，4H，CH2），3.30（dd，J =17.1，12.9 Hz，1H，3 -CH2），2.71（dd，J =17.2，3.0 Hz，1H，3 -CH2），2.50（p，J=1.9 Hz，2H，CH2），1.71（dp，J =21.6，6.9 Hz，4H，CH2），1.37 ～1.25（m，2H，CH2）.13C NMR（126 MHz，DMSO）δ 196.91（CO），166.82，163.22，162.89，157.82，137.21，128.71，128.39，128.28，119.27，115.20，102.55，95.04，94.13（Ar），78.63（CH），68.09，45.82，42.04，30.20，27.80，22.43（CH2）.HRMS（ESI）：（M +H）+计算相对分子质量409.168 5，实测相对分子质量409.168 0.

7，4′-氧-二-（4 -（N -咪唑基）-丁烷基）-柚皮素（化合物15）73 mg 黄色油状物，产率57%.核磁数据表征：1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ 12.02（s，1H，OH），7.53 ～7.44（m，2H，Ar），7.36（d，J =8.7 Hz，2H，Ar），7.07（dd，J =2.8，1.4 Hz，2H，Ar），6.98 ～6.87（m，4H，Ar），6.06 ～5.96（m，2H，Ar），5.35（dd，J =12.9，3.0 Hz，1H，CH），4.09 ～3.91（m，8H，CH2），3.08（dd，J =17.2，13.0 Hz，1H，3 - CH2），2.78（dd，J = 17.2，3.0 Hz，1H，3 -CH2），2.11 ～1.89（m，4H，CH2），1.89 ～1.63（m，4H，CH2）.13C NMR（126 MHz，CDCl3）δ 196.01（CO），167.04，164.14，162.92，159.23，137.10，137.08，130.57，129.60，129.55，127.81，118.82，118.78，114.73，103.22，95.45，94.52（Ar），78.96（CH），67.62，67.25，46.76，46.65，43.15，28.05，27.91，26.28，26.01（CH2）.HRMS（ESI）：计算相对分子质量517.237 3，实测相对分子质量517.238 5.

2 结果与讨论

柚皮素的化学结构含有三个羟基（图1），分别位于5 位7 位和4′位.鉴于羟基有助于提高水溶性，同时考虑5 位羟基与邻近羰基形成氢键不易反应，我们保留5 位羟基而对7 和4′位进行烷基化，再引入咪唑或者吗啉环得到终产物.碳链长度分别选取3、4、5 个碳原子，期望进行后期构效关系研究.在第一步反应中，用常见报道［10-11］的碳酸钾（2倍量）作碱，二溴化合物（2 倍量）作为反应试剂对柚皮素进行SN2亲核取代烷基化，结果原料大部分未参与反应.延长回流反应时间，原料仍大部分不反应，且发现7 位4′位双取代产物和5 位，7 位4′位三取代副产物.由于这2 种化合物极性均小，Rf 值相近，无法用柱层析分离.增加或减少碳酸钾的用量均不理想.我们推测可能是柚皮素溶解性太差，以及碳酸钾在有机溶剂中溶解度不高导致反应不理想.尝试改用更温和也溶于乙腈的有机碱DIPEA（二异丙基乙胺）作为反应的缚酸剂，回流过夜发现原料基本反应完毕，主产物为7 位单取代产物（化合物8 ～10），次产物为7 位4′位双取代产物（化合物11）.由于两者都是所需中间体且易分离，所以可采用一锅法同时得到2 种中间体，纯化后可分别用于下一步反应.单溴化物8 ～10 和双取代溴化物11 采用相似方法与吗啉和咪唑［12-13］分别进行SN2亲核取代得到相应的单/双取代终产物.在咪唑的反应中，咪唑既是反应试剂又是碱，仍应加入少量碳酸钾无机碱促进反应以提高产率.最终，以柚皮素为骨架，在其7 位4′位进行选择性烷基化得到单双取代中间体，进一步引入咪唑和吗啉环得到单/双取代终产物12 ～19 共8 个化合物.其中7 个终产物和4 个中间体为首次报道.采用一锅法同时得到单双取代烷基化产物也为首次报道，为以后黄酮类结构改造提供了借鉴.目标物的抗肿瘤活性仍然需要进一步研究，细胞活性实验一旦成功将对新药开发提供很大价值的信息和基础.