铽掺杂碳点的制备及其抑菌性能

李 宏，田 浩，于丽娟，高 哲，杨亚玲，李晚谊，*

(1.云南省农业科学院 农产品加工研究所，云南 昆明 650221； 2.昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650500)

随着城市化和工业化的发展，许多环境污染物，如有机染料和工业废水中的微生物被注入水源[1]，从而可能导致一些传染病的流行，威胁人类健康[2]。大肠埃希菌是微生物中的重要菌群，人体感染后可引起急性腹泻、呕吐、败血症等。因此，开发适用于处理大肠埃希菌污染的有效技术已成为亟待解决的问题。近年来，碳点光催化技术在解决此类问题上越发展现出其潜力：Venkateswarlu等[3]研发的用真菌衍生的光致发光碳点，对大肠埃希菌具有有效的光诱导杀菌活性；Das等[4]研发的用锌和氮掺杂的蓝绿色发光碳点，在光照条件下对大肠埃希菌同样显示出有效的光催化抑菌效果。

碳点(CDs)，是一种尺寸小于10 nm的碳纳米材料[5]，因具有低毒性、光学稳定性、环境友好性、生物相容性、高耐光漂白性等优点，近年来受到了广泛的关注[6-7]。通常，碳点表面富含羟基、羧基和胺基等官能团[8]，使其具有单分散性强、溶解度高等特点。由于其自身的良好性质，碳点已广泛应用于生物成像[9-10]、药物输送[11]、光电和能量装置[12]、荧光油墨[13]、光催化[14-16]和传感器等领域[17]。碳点可以通过自上而下(激光烧蚀、化学气相沉积等)和自下而上(水热、电沉积、溶剂热等)的方法合成，主要来自化学和绿色资源的各种前体[18-19]。

本研究以马铃薯为碳源，通过一步水热法合成碳点[4]，再将铽与碳点在室温下搅拌，最终制备成铽掺杂的碳点。所合成的碳点富含羟基、羧基等，容易进行后续的改性和应用。此外，还探索了铽掺杂的碳点在光催化条件下对大肠埃希菌的抑制作用，及其对大肠埃希菌进行荧光标记的可行性[20-21]，旨在为进一步利用碳点开展微生物抑菌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

蛋白胨、酵母粉、琼脂、葡萄糖，生物试剂，北京索莱宝科技有限公司；氯化钠，分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司；三氯化铽六水合物，上海麦克林生化科技有限公司；马铃薯，购于当地超市。

1.2 仪器

UV-2550型紫外可见分光光度计(日本，岛津公司)，TENSOR27型傅里叶变换红外光谱仪(德国，BRUKER公司)，G9800A型荧光分光光度计(美国，安捷伦公司)，TecnaiG2TF30型场发射透射电子显微镜(TEM)(荷兰，FEI公司)，THZ-100型恒温培养摇床(上海一恒科学仪器有限公司)，VS-1300型洁净工作台(苏州净化设备有限公司)，Thermo Scientific 3913型恒温培养箱(美国，Thermo Scientific公司)，YXQ-LS-75G型灭菌锅(上海博迅实业有限公司)，120 mL聚四氟乙烯内衬水热反应釜(上海一凯仪器设备有限公司)，FA1004型电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)，S-4800 FE型场发射扫描电子显微镜(SEM)(日本，Hitachi公司)，TCS-SP5型共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)(德国，Leica公司)。

1.3 供试菌种

选用的菌种为大肠埃希菌(Escherichiacoli)，系革兰氏阴性致病菌。

1.4 铽掺杂碳点(Tb-CDs)的制备

称取马铃薯干粉3 g，加入100 mL去离子水中，将得到的悬浮液加入到120 mL聚四氟乙烯内衬水热反应釜的内衬中，将其放入马弗炉中在180 ℃条件下加热6 h，自然冷却至室温后，将得到的溶液以8 000 r·min-1的转速离心10 min以去除不溶于水的大颗粒物质，再用0.22 μm的滤膜过滤掉大分子物质。最后，将得到的溶液在60 ℃真空干燥箱中干燥，得到CDs固体粉末。

将三氯化铽配制成浓度0.1 mol·mL-1的溶液。称取0.2 g的CDs固体粉末溶于20 mL去离子水中制备CDs溶液，将制备的CDs溶液和5 mL的三氯化铽溶液加入三颈烧瓶中，在室温下磁力搅拌5 h，所得到的溶液即为Tb-CDs溶液，置于60 ℃真空干燥箱干燥，得到Tb-CDs固体粉末。

1.5 抑菌实验

1.5.1 菌体活化与菌液制备

将冷冻保存的大肠埃希菌菌种与5 mL菌种所需的液体培养基进行混合，于37 ℃、200 r·min-1的条件下在摇床上培养12 h。血球计数板计数菌液浓度(控制大肠埃希菌的菌液浓度为1×106CFU·mL-1)。

1.5.2 抑菌材料的光催化抑菌实验

将Tb-CDs、CDs分别加入含有5 mL菌液的石英试管中混合均匀，Tb-CDs的质量浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1，CDs的质量浓度为0.6 mg·mL-1。随后，将样品溶液置于可见光下照射不同的时间间隔，判断抑菌剂的抑菌效果。在无光照条件下重复相同的实验步骤。此外，在相同条件下开展不加Tb-CDs、CDs的空白实验(CK)

1.5.3 稀释平板计数法计算Tb-CDs对大肠埃希菌的抑菌率

在超净工作台上，将LB培养基(121 ℃灭菌20 min)倾斜倒入培养基平板上，待其凝固。将100 μL含有碳点的菌液加到已凝固的培养基平板上，再用涂布器快速将其均匀涂布，37 ℃培养箱中倒置培养12 h。每组实验均做3个平行。用平板计数法计算每个平板菌落的数量。计算每组实验中3个平行实验的菌落数平均值，作为该组实验的最终菌落数。计算Tb-CDs对大肠埃希菌的抑菌率。

1.6 Tb-CDs对大肠埃希菌的荧光标记

将大肠埃希菌在LB培养基中孵育。大肠埃希菌菌悬液与Tb-CDs在37 ℃无光振荡培养2 h，4 000 r·min-1离心收集大肠埃希菌菌体。然后，用无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤大肠埃希菌菌体，4 000 r·min-1离心6次以除去未进入细菌细胞的培养基和Tb-CDs，分别在405、488、555 nm激发波长的CLSM上进行荧光成像。

2 结果与分析

2.1 Tb-CDs的透射扫描电镜、红外、紫外、荧光光谱

由紫外吸收光谱(图2)可知，Tb-CDs的紫外吸收范围较宽，在300 nm和375 nm处有最大吸收峰，分别是Tb-CDs SP2区域的π-π*、n-π*跃迁[24-25]。

如图3-a所示，Tb-CDs的最大激发波长和最大发射波长分别是360、442 nm，即在激发波长为360 nm时，该碳点的最大发射波长为442 nm。在自然光下，Tb-CDs溶液呈淡黄色；在紫外灯照射下，Tb-CDs溶液呈现明亮的蓝色荧光。图3-b为Tb-CDs在不同激发波长下的发射波长，可以看出，Tb-CDs在激发波长为360 nm处有最大发射波长。

2.2 Tb-CDs和CDs对大肠埃希菌的光催化抑菌效果

探究Tb-CDs(0.6 mg·mL-1)分别在无光和光照条件下对大肠埃希菌的抑菌效果。如图4-a所示，Tb-CDs对大肠埃希菌的抑菌作用在无光条件下不明显，光照40 min时抑菌作用明显。图4-b为大肠埃希菌在Tb-CDs无光和光照(40 min)处理下活菌数的对数值，结果显示，Tb-CDs在可见光照射下能将大肠埃希菌杀死，有较强的抑菌效果。

图1 Tb-CDs的TEM图像(a)和红外光谱图(b)Fig.1 Transmission electron microscope image (a) and Fourier transform infrared spectrum (b) of Tb-CDs

图2 Tb-CDs的紫外光谱Fig.2 Ultraviolet-vis absorption spectrum of Tb-CDs

将Tb-CDs和CDs对大肠埃希菌的抑菌效果进行对比。如图5所示，在相同质量浓度下(0.6 mg·mL-1)，CDs对大肠埃希菌的抑制作用随着光照时间延长没有明显变化，抑菌效果不明显；而Tb-CDs对大肠埃希菌的抑制作用随着光照时间的延长显著增强。当光照时间为60 min时，Tb-CDs对大肠埃希菌的抑菌率达到了100%，明显大于CDs对大肠埃希菌的抑菌率。

2.3 不同质量浓度Tb-CDs对大肠埃希菌的光催化抑菌效果

探究Tb-CDs在不同质量浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1)下对大肠埃希菌的抑菌效果。如图6所示，Tb-CDs对大肠埃希菌的抑菌率随着碳点质量浓度的增加而增大，当碳点的质量浓度达到0.6 mg·mL-1时，其对大肠埃希菌的抑菌率最大；之后，进一步增加Tb-CDs的质量浓度时，其对大肠埃希菌的抑菌率没有明显变化。

图3 Tb-CDs的荧光光谱(a)和光致发光发射光谱(激发波长为310～400 nm)(b)Fig.3 Fluorescent spectra (a) and photoluminescent emission spectra (excitation wavelength of 310-400 nm) (b) of Tb-CDs

图4 大肠埃希菌在Tb-CDs无光和光照(40 min)处理下菌落的生长情况(a)及其活菌数量(b)Fig.4 Growth (a) and bacterial quantity (b) of E. coli under dark and light (irradiation of 40 min) enviroment with Tb-CDs

图5 大肠埃希菌在CDs(a)和Tb-CDs(b)处理下菌落的生长情况及其细胞数量变化(c)，和Tb-CDs与CDs对大肠埃希菌的抑菌率(d)Fig.5 Colony growth of E. coli treated with CDs (a) or Tb-CDs (b) and changes of bacterial quantity (c)， and antibacterial rate of CDs or Tb-CDs against E. coli(d)

图6 不同质量浓度的Tb-CDs对大肠埃希菌菌落生长(光照60 min)的影响(a)及其对大肠埃希菌抑菌率的动态变化(b)Fig.6 Colony growth of E.coli under different concentrations of Tb-CDs (irradiation of 60 min) (a) and dynamics of antibacterial rate of different concentrations of Tb-CDs against E.coli(b)

2.4 Tb-CDs对大肠埃希菌的光催化抑菌机制分析

Tb-CDs对大肠埃希菌的光催化抑菌作用归因于活性氧(ROS)的影响，如羟基自由基(HO·)、超氧离子(O2·-)、空穴(h+)等[16，26-27]。如图7所示，在可见光照射下，电子从Tb-CDs的价带转移至导带，从而形成e--h+对。游离的e-可与O2反应生成O2·-，而h+则与—OH结合产生HO·。该反应过程中产生的光生e-、h+和自由基可破坏细胞包膜的完整性，并导致其死亡。

图7 在可见光照射下Tb-CDs光催化灭活大肠埃希菌的示意图Fig.7 Schematic of photocatalytic inactivation of E. coli by Tb-CDs under visible-light irradiation

通过SEM观察微生物表面的形状变化[28]。图8-a显示了光催化抑菌前大肠埃希菌的SEM图像，从中可以观察到保存完好的细胞壁。如图8-b、c所示，在光催化条件下，Tb-CDs加入后，大肠埃希菌的细胞壁开始起皱收缩，细胞壁变形，在细胞壁表面出现多处小的凹坑和突出点，照射结束时，几乎整个细胞表面都被孔隙占据，导致细菌细胞完全扭曲。这表明，在光催化抑菌过程中，Tb-CDs与大肠埃希菌的细胞壁有多个相互作用位点，从而导致细胞壁的破坏。其破坏机理可能是，在抑菌过程中，Tb-CDs与大肠埃希菌细胞相互接触，并在光照条件下产生自由基，自由基作用于细胞的磷脂层，细胞被破坏，进而诱发细胞膜渗透性的改变[29]，细胞外的物质进入细胞，导致细胞失活，最终引发细胞死亡。

2.5 Tb-CDs对大肠埃希菌的荧光标记

Tb-CDs具有优异的荧光性能和良好的生物相容性，因此可以作为荧光探针来对大肠埃希菌进行荧光标记。Tb-CDs的尺寸小，大肠埃希菌能很好地摄取Tb-CDs。本研究利用CLSM验证了Tb-CDs对大肠埃希菌的标记。大肠埃希菌在与Tb-CDs孵育2 h后，表现出强烈的荧光。如图9所示，将其分别在405、488、555 nm波长下激发时，可分别观察到蓝、绿、红等多色荧光，说明利用Tb-CDs可以对大肠埃希菌进行荧光标记。

图8 大肠埃希菌(a)及与Tb-CDs在光照下共存40 min(b)的SEM图像Fig.8 Scanning electron microscope image of E.coli(a) and E.coli treated with Tb-CDs (b, c) under irradiation of 40 min

图9 Tb-CDs标记的大肠埃希菌的荧光图像Fig.9 Fluorescent images of E. coli labeled with Tb-CDs

3 结论

以马铃薯为原料，通过一步水热法合成了CDs，再将稀有金属铽与CDs通过室温搅拌，混合后合成了Tb-CDs。通过透射扫描电镜、紫外光谱、红外光谱、荧光光谱等对Tb-CDs的形态结构进行表征，并以革兰氏阴性菌——大肠埃希菌为模型，研究了Tb-CDs的光催化抑菌性能。结果显示，在光照条件下，Tb-CDs能有效地抑制大肠埃希菌的生长，并显示出良好的抑菌效果。此外，Tb-CDs还可以对大肠埃希菌进行荧光标记，在不同激发波长下显示出不同颜色的荧光。本研究不仅拓宽了碳点的制备方法，而且也为碳点的功能化和生物应用奠定了基础。