金盏菊根尖细胞染色体制片与核型分析

龙海梅，张楠卿， 李宗艳，*，王 琴，付 超

(1.西南林业大学 国家林业和草原局西南风景园林工程中心，云南 昆明 650224; 2.西南林业大学 功能花卉研究中心，云南 昆明 650224)

染色体数目和核型在物种系统分类、起源与鉴定、亲缘关系分析等方面具有重要的应用价值，高质量的染色体制片是进行核型分析和原位杂交的保障[1]。染色体制片技术主要有压片法、涂片法和滴片法等。压片法对去壁要求较低且材料不易丢失，该法适用于大量材料的倍性鉴定、染色体计数、初步的染色体形态观察[2-3]。菊科植物体细胞小、细胞质较浓，染色体数目多，多数栽培菊花染色体数为54～71。由于菊属植物种间远缘杂交较易成功，导致染色体倍性复杂，有二倍体、四倍体、六倍体等[4]，因而，菊科植物染色体制片难度较大。围绕菊科植物起源与品种演化的问题，目前的研究主要从野生种质材料的染色体结构、数量、核型带型的角度，开展了菊属植物染色体倍性、形成演化、分类和种间亲缘关系等研究[5-7]。园林园艺生产中应用的菊科植物丰富，广泛地应用于花坛、花境、盆花、切花等。目前仅对百日草(Zinniaelegans)、蛇目菊(Sanvitaliaprocumbens)、向日葵(Helianthumannuals)、孔雀草(Tagetespatula)等少数植物的染色体制片技术进行过探索[8-11]，尚未见有关金盏菊染色体制备技术相关的报道。菊科栽培植物起源较复杂，染色体组信息对揭示其起源具有重要意义。本研究以我国园林中广泛引种栽培的2年生草本植物金盏菊(Calendulaofficinalis)为材料，探索菊科植物根尖染色体压片制片的关键环节和其染色体数目，为其染色体制片技术和核型分析提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

供实验用的金盏菊种子由云南碧青园艺有限公司提供。将种子用2 g·L-1高锰酸钾溶液浸泡20 min，用清水洗净后播种于垫有滤纸的培养皿中，置于22 ℃光照培养箱中进行催芽。

1.2 方法

1.2.1 取材与有丝分裂活动

分别从08：00至11：30和14：00至17:00，每隔30 min取样，用对二氯苯饱和溶液、500 mg·L-1秋水仙素和0.004 mol·L-18-羟基喹啉溶液处理根尖，寻找有丝分裂活动旺盛的时段；在根尖长至0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 cm时取顶端幼嫩部分根，用0.004 mol·L-18-羟基喹啉溶液处理。从10个不同植株上取样，每个样本取3次。所有材料在6 ℃预处理6 h，清洗后用福尔马林-乙醇-醋酸(FAA)固定。

1.2.2 试剂预处理

选用对二氯苯饱和溶液、500 mg·L-1秋水仙素、0.004 mol·L-18-羟基喹啉预处理根尖，置于6 ℃恒温箱中，分别处理4、6、8、10、12、14 h。比较试剂种类与处理时间对有丝分裂中期相染色体固定效果的影响。

将固定材料用清水清洗3次后，放入1 mol·L-1的盐酸中，于60 ℃水浴处理9～10 min，清洗根尖并将其捣碎，加入卡宝品红试剂染色8～12 min，进行压片。在生物摄像显微镜下镜检计数和拍照，3次重复。观察30个清晰可辨的分裂相细胞。

1.3 制片效果评价与核型分析

在Olympus生物显微镜10倍镜下进行初步镜检，有丝分裂活动能力以分裂相比例作为评价指标，以1个视野中有丝分裂相细胞占细胞总数比例≥4/5为分裂相极多，比例在3/5≤～4/5为分裂相多，2/5≤～3/5为分裂相较多，1/5≤～2/5为分裂相较少，<1/5为少，<1/10为极少。染色体形态评价指标为染色体分散性好，收缩适中，形态良好，着丝粒清晰可见，细胞背景干净。

染色体计数方法如下：从每个处理中选出中期相细胞进行计数，共计30个细胞，且有80%以上的细胞具有相同数量的染色体。在40倍镜下对图像比较清晰、染色体相对分散、收缩比较好的分裂相拍照，测量染色体的短臂、长臂，计算相对长度和染色体相对长度系数，统计染色体臂比、相对长度系数，然后依据着丝点位置和形态进行同源染色体配对，并绘制染色体核型模式图。计算公式[11]：相对长度=(染色体长度/染色体组总长度)×100；染色体相对长度系数=染色体长/全组染色体平均长度。

染色体命名使用Levan法则[12]，分为正中部着丝点(M)、中部着丝点(m)、近中部着丝点(sm)、端部着丝点(t)、近端部着丝点(st)类型。按李懋学等[13]的核型标准进行分析，核型不对称性按照Stebbins[14]的分类标准，依据最长与最短染色体比值和臂比值占有比例划分类型。核型不对称系数=染色体长臂总长/全组染色体总长×100%。

2 结果与分析

2.1 取材时间对染色体制片的影响

方差分析结果表明，有丝分裂中期相的细胞数量差异显著，上午08：30—09：30取材效果较好，能获得较多的处于有丝分裂中期相细胞，可固定的有丝分裂中期相的细胞数约3.3～9.0个(表1)。在相同时段，不同试剂的预处理效果有差异。上午08：30—09：30，0.004 mol·L-18-羟基喹啉溶液处理效果优于对二氯苯处理，固定的有丝分裂中期相的细胞数为7.3～9.0，500 mg·L-1秋水仙素处理仅能固定3.3～5.0个中期相细胞。总体来说，金盏菊细胞在上午08：30—09：30有丝分裂活动旺盛。

2.2 根长对制片效果的影响

在有丝分裂旺盛期取材，统计不同根长的金盏菊有丝分裂细胞比例，结果(表2)表明，在根长为1.0～1.5 cm时取材，能固定获得较多的有丝分裂中期相细胞，细胞大小和细胞成熟度适宜，后期解离和压片效果较好。但随着根的不断生长，根长超过1.5 cm后，虽然可以得到一定数量的有丝分裂中期相细胞，但由于根尖细胞成熟度的增加，细胞壁较厚，对固定、后期细胞解离和压片过程有一定影响，染色体较难分离在同一平面上。根长超过2.5 cm，固定的有丝分裂中期相细胞少，且根毛发育旺盛，影响制片效果。根长为0.5 cm时，根尖细胞排列紧密，有较多的有丝分裂的细胞，但细胞太小，染色体难分开，制片效果亦不理想。

2.3 预处理试剂与处理时间对染色体制片的影响

由图1可知：对二氯苯饱和溶液处理金盏菊6 h，染色体形态较清晰，浓缩程度适宜，易于观察着丝点。从染色体形态结构的清晰度考虑，采用500 mg·L-1秋水仙素处理效果最差，因为金盏菊染色体较长，浓缩程度不足，较难显示染色体着丝点的位置。对不同预处理时间的效果进行比较发现，0.004 mol·L-18-羟基喹啉处理8 h，可获得浓缩程度良好、清晰度较高的染色体。总体来说，使用对二氯苯饱和溶液处理6 h可达到较好的效果。

表1 不同时段取材对金盏菊有丝分裂活动的影响Table 1 Effects of sampling time on mitotic activity of Calendula officinalis

A为饱和对二氯苯；B为500 mg· L-1秋水仙素；C为0.004 mol·L-18-羟基喹啉溶液。同行数据后无相同字母表示在0.05水平差异显著。
A represented the treatment of saturated solution of P-dichlorobenzene; B represented the treatment of 500 mg·L-1colchicine; C represented the treatment of 0.004 mol·L-18-Hydroxyquinoline. Data marked without the same lowercase letter in each row indicated significant differences atP<0.05.

表2 根长对有丝分裂相细胞比例和染色体制片的影响Table 2 Effects of root length on percentage of mitotic cells and chromosome technique

A，对二氯苯饱和溶液处理金盏菊6 h(×400)；B，500 mg·L-1秋水仙素处理金盏菊6 h(×400)；C，0.004 mol·L-1 8-羟基喹啉溶液处理8 h(×400)。A， Chromosomes treated by saturated solution of p-dichlorobenzene for 6 h (×400) ; B， Chromosomes treated by 500 mg·L-1 colchicine for 6 h (×400); C， Chromosomes treated by 0.004 mol·L-1 8-hydroxyquinoline for 8 h (×400)图1 不同预处理条件下金盏菊的染色体制片效果Fig.1 Effect of different pretreatments on chromosome morphology of Calendula officinalis

2.4 染色体数目和核型分析

随机选取形态清晰、分散良好的染色体图像拍照，从中选择5个测量金盏菊根尖细胞染色体的相关参数，分析染色体数量、着丝点类型，结果见表3。依据染色体形态、长度和着丝点进行同源染色体配对，金盏菊体细胞染色体数目为39～46，其中28条正常染色体，染色体相对长度为5.93%～8.46%(图2)，相对长度系数为0.83～1.18；臂比最大为2.34，位于第8号染色体，臂比最小为1.01，位于第10号染色体。中部着丝点染色体数目为9对18条，近中部着丝点染色体数目为5对10条。金盏菊体细胞中有多达18条染色体的长度不到最小常染色体的1/2，属于B染色体，按形态分有短棒状和点状2种类型。其中，短棒状B染色体数量较多，在观察的细胞中有多达18条；点状染色体一般为1～3条。金盏菊最长常染色体与最短B染色体比值为4.05。臂比值大于2的常染色体在染色体组的比例为14.29%。依据Stebbins标准，金盏菊核型为2B类型，其核型公式2n=18m+10sm，核型不对称系数为60.24%(图2)。

表3 金盏菊根尖细胞染色体参数Table 3 Parameters of tip cells chromosome of Calendula officinalis

m，中部着丝点；sm，近中部着丝点。
m， Median region; sm， Submedian region.

图2 金盏菊染色体核型模式图Fig.2 Chromosome karyotype of Calendula officinalis

3 讨论

染色体的细胞制片技术研究主要集中于细胞有丝分裂旺盛期确定、有效材料选择、预处理试剂和方法等，从不同角度探讨对制片效果的影响。百日草、万寿菊(Tageteserecta)的根尖在上午08:00—09:00，花药在上午09:00—10:00取材，染色体制片效果较佳[15-16]；在材料的成熟度方面，孔雀草根尖长约0.5 cm时，滁菊根尖长度为1 cm左右，均可获得较好的中期固定相和解离效果[10，17]。在预处理试剂种类和浓度的选择上，百日草、孔雀草以饱和对二氯苯溶液或0.002 mol·L-1的8-羟基喹啉液预处理4～8 h效果较好；风毛菊属(Saussurea)、帚菊属(Pertya)、针苞菊属(Tricholepis)植物和甜菜(Betavulgarisvar. cicla)较佳的预处理试剂为0.002 mol·L-18-羟基喹啉；使用0.002 mol·L-18-羟基喹啉和0.1 mol·L-1秋水仙素混合处理滁菊效果较好，采用饱和对二氯苯处理栽培菊效果也较佳[6，10，15，17-19]。本试验结果表明，金盏菊在早上08：30—09：30、根长为1.0～1.5 cm时取材，采用饱和对二氯苯处理，染色体制片效果较佳。

栽培菊花品种大多为六倍体至八倍体或非整倍体，染色体数目变幅极大，从2n=36、45、51～75+B到85，以2n=54为分布高峰。李懋学等[4]对我国21个菊花栽培品种进行染色体观察发现，栽培菊花从小菊、中菊到大菊品种，染色体数目与花径存在一定正相关。日本野生菊有染色体基数为9的二倍体、四倍体、六倍体、八倍体、十倍体，以及少数异数体[20]。全球矢车菊属(Centaurea)植物包括500～600个自然种，染色体基数为7～16，已发现有二倍体、三倍体、四倍体和六倍体，二倍体染色体数目从16至66不等[21]。Fedorov[22]统计了93种广义菊属植物的染色体数目，发现多倍体(包括种内多倍体)有56种，占60%，多倍化显然是该属植物的一个重要的进化途径。其他常见的菊科栽培植物的染色体数目不多，万寿菊2n=24，向日葵2n=34，蛇目菊2n=24，大花金鸡菊(Coreopsisgrandflora)2n=26，孔雀草2n=4x=48，栽培雏菊(Bellisperennis)品种2n=18。除孔雀草为四倍体外，向日葵倍性不详，其他都为二倍体，雏菊染色体类型为M和m，其他种的染色体类型有m和sm型，所有种的核型属于1B或2B，这些栽培植物的染色体形态均正常[8-11，15，23]。本次研究的金盏菊染色体数目为39～46，常染色体数目为28，首次发现染色体组中除了正常染色体外，还有11～18条B染色体，且B染色体的类型多样，呈短棒状的且有着丝点的B染色体数量不稳定，呈点状无明显着丝点的B染色体一般为1～3条。

B染色体在生物界广泛分布，大小约为最小常染色体的一半，其存在对物种的意义一直是学术界争论的问题。一般研究认为，B染色体的存在对物种的影响通常表现为中性，在特定环境中B染色体出现频率的增加能显著提高个体的适应性[24-25]。在有选择压力的环境中，具有B染色体的黑麦草属(Lolium)植物个体常表现出更强的竞争力和适应能力[26]。大部分生物体的B染色体数量往往不稳定，如菊属植物广泛存在B染色体，但在栽培品种中出现B染色体的概率要高于野生种。B染色体在不同类型菊花品种中出现的概率约为10.9%，非整倍体出现的概率高于整倍体，绝大多数品种有1条B染色体，少数有2条[7]。中甸风毛菊(Saussureadschungdienensis)有1条B染色体[18]。虎眼万年青(Ornithogalumcaudatum)的常染色体有18条，B染色体的数量变异较大，有22～28条，超出常染色体数量[27]。玉米(Zeamays)地方品种B染色体的数量为0～2[28]。在玉米地方品种研究中发现，短杆状B染色体有明显的着丝粒和姐妹染色单体，能进行正常的有丝分裂，而点状的B染色体呈高度染色质化，无明显的着丝粒和姐妹染色单体，不能进行正常的有丝分裂，造成在不同细胞中数量不同[29]。目前尚无这2类B染色体存在的生物学意义的相关研究。本研究中金盏菊常染色体数量为28，B染色体数量为18条，在当前栽培的菊科植物中，是发现B染色体数量最多的种，尚不清楚B染色体数量与其抗性和适应性变异有无相关性。