咖啡酸苯乙酯抗肿瘤活性的研究进展

李焕平，刘可微，郝玉琴，朱永蒙

(内蒙古包钢医院a.药学部，b.皮肤科，c.泌尿男科，内蒙古 包头 014010)

癌症是全球人类死亡的主要原因之一。根据癌症的类型和阶段，可以使用手术切除、化疗及放疗等治疗方法控制患者病情，选择性杀死癌细胞。目前，针对特定遗传驱动因子的靶向疗法和针对恶性细胞的免疫疗法是癌症治疗的研究热点。虽然治疗方法很多，但癌细胞的治疗抵抗、远处转移等多种因素可导致患者死亡。同时，药物的毒性、不良反应以及耐药性等也会影响治疗效果，故迫切需要寻找新的治疗方法。

来自植物、动物、海洋生物、真菌、细菌以及其他生物的天然产物是现代药物发展的重要来源，生物相关性和结构多样性使天然产物成为药物设计的良好起点[1]。天然植物蜂胶是蜜蜂从各种植物中采集的树脂材料，因具有多种生物和药理活性，如抗菌、抗病毒、抗肿瘤等，被广泛应用于民间医药、食品以及饮料中，用以改善健康和预防疾病[2]。咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester，CAPE)是咖啡酸的衍生物,作为蜂胶提取物的主要活性成分之一,其具有多种重要的生物学特性，包括抗癌、抗炎以及抗氧化等[3-5]。已有研究表明，CAPE对多种肿瘤细胞具有细胞毒性，且不侵犯正常细胞，同时还能够抑制肿瘤细胞的增生、浸润和转移[6]。近年来，CAPE在癌症治疗领域又进行了更广泛的研究，现就CAPE的抗肿瘤活性及部分相关机制进行综述。

1 CAPE

CAPE的化学名称是3-(3′,4′-二羟基苯基)-2-丙烯酸苯乙醇酯，其分子式为C17H16O4，化学结构如图1所示。CAPE是一种在儿茶酚环内具有羟基的多酚，由于具有儿茶酚胺类结构的化合物均有两个邻位酚羟基,苯环上电子密度高,所以极易自动氧化成邻醌，进而环合、聚合而呈色。研究表明，CAPE具有抗肿瘤、抗微生物、抗氧化、抗炎、抗缺血再灌注损伤及细胞毒等生物活性[7]。Murtaza等[7]首次从以色列蜂胶中鉴定出这种疏水性多酚，CAPE及其相关化合物约占19%。但不是所有蜂胶中均含有CAPE,北温带蜂胶样品中大部分含有CAPE，而南美、巴西以及其他南部和热带地区的蜂胶中不包含CAPE。因世界各地蜂胶来源不同，CAPE的含量也不同，其中属中国河北省蜂胶含量最高(29.2 mg/g)[8]。虽然可以从蜂胶中提取CAPE，但提取率非常低,因而其开发利用受到限制。目前已有学者利用化学方法合成了CAPE，从而解决了提取率低的问题,实现了大规模生产[7]。

图1 咖啡酸苯乙酯的化学结构

2 CAPE的抗肿瘤活性

2.1乳腺癌 乳腺癌是世界上最常见的肿瘤疾病之一，也是全球女性死亡的第二大原因[9]。约30%的早期乳腺癌患者发生转移，其中约5%诊断为晚期远处转移，而转移性乳腺癌患者5年生存率仅为23%[10-12]。

Watabe等[13]研究发现，在人乳腺癌MCF-7细胞中，CAPE通过Fas配体非依赖性机制激活Fas，诱导促凋亡因子Bcl-2相关X蛋白和胱天蛋白酶活化。同时，CAPE还能激活促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族蛋白p38和c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)[13]。这些可归因于CAPE对核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)的抑制。

Wu等[14]在乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231中研究了CAPE的作用，结果发现，CAPE对肿瘤细胞基因和蛋白质的表达影响较大，抑制细胞生长，但对正常乳腺细胞影响较小。CAPE诱导细胞周期停滞、细胞凋亡，并减少生长和转录因子的表达，包括NF-κB。同时，CAPE还可下调MDR-1基因的表达，该基因被认为是癌细胞对化学制剂产生抗性的原因[14]。此外，CAPE能抑制MDA-MB-231细胞血管内皮生长因子和内皮细胞生成的毛细血管样血管的形成，提示其对血管生成有抑制作用[14]。

有学者比较了CAPE与咖啡酸在乳腺癌中的抑制活性。结果显示，在乳腺癌MDA-MB-231细胞中，CAPE较咖啡酸有更高的细胞毒活性[15]；而在MCF-7细胞中，CAPE的迁移抑制作用较咖啡酸更明显[16]。以上研究证明，与咖啡酸相比，CAPE在相同剂量和时间下抗肿瘤活性更强。

2.2卵巢癌 卵巢癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其高侵袭性及对药物的不敏感是治疗的难点。目前，细胞及动物实验中均证明了CAPE对卵巢癌治疗的影响。在细胞实验中，CAPE作用于卵巢癌细胞株A2780和A2780cis，其中前者对化疗不敏感；四唑盐比色法、流式细胞术以及实时定量基因扩增荧光检测结果显示，在两种细胞株中细胞增殖减少并激活凋亡、促凋亡基因BAD、CASP8、FAS、FADD、p53等[17]。这表明，CAPE不仅能抑制卵巢癌细胞的生长，还可增加癌细胞对化疗的敏感性。在动物实验中，尾静脉注射卵巢癌细胞SKOV-3建立小鼠卵巢癌模型后用CAPE处理发现，SKOV-3细胞的活力、迁移力和侵袭力明显降低[18]。此外，CAPE还能促进SKOV-3细胞凋亡，在体内抑制卵巢癌的生长，表现出极好的抗肿瘤活性[18]。CAPE可能是通过抑制NF-κB抑制蛋白磷酸化、p65核转位和NF-κB p65 DNA结合活性3种方式抑制NF-κB信号转导[18]。用NF-κB p65 干扰小RNA转染的SKOV-3细胞表现出细胞活力下降，迁移、侵袭减少及细胞凋亡增加，而CAPE处理可增强NF-κB p65 干扰小RNA在SKOV-3细胞中诱导的这些改变，证明CAPE可通过灭活NF-κB信号转导通路抑制卵巢癌的进展[18]。

2.3前列腺癌 前列腺癌是指发生在前列腺的上皮恶性肿瘤，是世界第五大常见癌症，超过80%的患者死于骨转移[19]。2012年我国肿瘤登记地区前列腺癌的发病率为9.92/10万，居男性恶性肿瘤发病率的第六位[20]。有学者研究了CAPE在前列腺癌中抗肿瘤作用的信号转导途径。CAPE通过抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B (phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信号转导途径抑制人前列腺癌细胞的生长，同时CAPE治疗也减少了所需化疗药物的剂量，并减轻由各种癌症化疗或放疗导致的器官损伤和毒性[21]。Transwell和切口愈合测定证明，CAPE抑制了前列腺癌细胞PC-3和DU-145的迁移和侵袭[22]；明胶酶谱和蛋白质印迹表明，用CAPE处理细胞后基质金属蛋白酶-9和基质金属蛋白酶-2的丰度和活性降低[22]；使用Micro-Western Array分析表明，CAPE在非经典Wnt通路中诱导受体酪氨酸激酶样孤儿受体2信号通路表达,抑制了β联蛋白表达、NF-κB的活性、PI3K/Akt信号转导以及上皮-间充质转化[22]。而受体酪氨酸激酶样孤儿受体2的过表达或敲低分别抑制或增强了PC-3细胞的迁移[22]。体内实验显示，CAPE处理增加了受体酪氨酸激酶样孤儿受体2和Wnt5a的丰度，减少了Ki67、Frizzle 4、NF-κB p65、基质金属蛋白酶-9、Snail、β联蛋白以及NF-κB抑制蛋白α磷酸化蛋白的表达[22]。

CAPE通过激活非经典Wnt信号转导途径，抑制经典Wnt信号转导途径以抑制前列腺癌的转移。这首次证明了CAPE可刺激非经典Wnt信号转导，但抑制经典Wnt信号转导。

2.4神经胶质瘤 胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤之一。虽然目前已有多种治疗方法，如手术、放疗以及替莫唑胺化疗等，但胶质瘤患者的存活率仍极低。在神经胶质瘤细胞实验中，CAPE显示了良好的抗肿瘤活性。Kuo等[23]研究了CAPE体内抗神经胶质瘤细胞的潜能发现，CAPE显著降低了裸鼠C6胶质瘤异种移植物中有丝分裂细胞和增殖细胞核抗原的数量，且G0/G1期细胞数百分比增加至85%，说明CAPE具有抗肿瘤活性。同时该研究还指出，当CAPE处理浓度超过10 μmol/L时，对C6胶质瘤细胞产生显著的抗增殖作用[23]。

有学者用CAPE处理C6癌细胞系后测定DNA片段、MAPK和神经生长因子(nerve growth factor，NGF)/p75神经营养素受体(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)的水平，以及鞘磷脂酶的活性和神经酰胺含量，并进行蛋白质印迹分析。结果显示，CAPE通过激活中性鞘磷脂酶，上调神经酰胺水平，激活MAPK通路，包括胞外信号调节激酶、JNK和p38 MAPK，此外CAPE也增加了NGF/p75NTR的表达[24]。NGF/p75NTR是N-鞘磷脂酶/神经酰胺的下游靶标，而胞外信号调节激酶和JNK分别作用于NGF/p75NTR的上游和下游[24]。以上研究初步证实了CAPE治疗神经胶质瘤的潜力，为后续研究打下良好基础。

Balkhi等[25]研究了CAPE与达沙替尼联合治疗神经胶质瘤的效果。结果显示，两者联合应用明显减少了体内胶质瘤细胞的增殖，且未见与药物相关的耐药性和不良反应，提示这种治疗方案具有较好的应用前景。

2.5白血病 白血病又称为血癌,是一种造血细胞的恶性增生性疾病,其致死率高。早期有研究发现，CAPE通过抑制HL-60细胞中DNA、RNA以及蛋白质的合成从而抑制人白血病HL-60细胞的生长[26]。而后又有多位学者深入研究了CAPE诱导白血病细胞凋亡的作用及相关机制。

研究发现，用CAPE处理白血病U937细胞后细胞的活性降低，凋亡标志物增加[27]。CAPE的凋亡作用伴随细胞色素C的释放、凋亡抑制基因Bcl-2表达减少、促凋亡基因Bcl-2相关X蛋白表达增加、胱天蛋白酶3以及多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶的激活裂解，通过介导线粒体而非通过Fas蛋白、磷酸化真核起始因子2α、转录调节因子C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)、雌激素受体介导的细胞凋亡起作用[27]。另一项研究证实，CAPE具有抗淋巴母细胞系PL104细胞的活性，且其抗肿瘤活性较多柔比星、长春新碱及蛋白酶体抑制剂MG132更强[28]。上述研究表明，CAPE抑制白血病细胞的机制是通过线粒体内在途径诱导。虽然已有关于CAPE针对白血病细胞的研究，但尚未应用于动物模型且药物毒性不清楚，故有待进一步研究论证。

2.6肝细胞癌 肝细胞癌是原发性肝癌中最常见的类型，占全球所有癌症发病率的7%，且发病率随年龄的增长而增加[29]。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)是目前研究较为广泛的抗癌剂，其优先诱导癌细胞凋亡，对正常细胞的毒性可忽略不计。已有研究证实，CAPE通过调节p38和JNK信号转导途径上调TRAIL受体，从而增强了TRAIL诱导的肝癌SK-Hep1细胞凋亡[30]。也有学者研究了CAPE处理肝癌Hep3B细胞后能否促进TRAIL介导的细胞毒性。该研究表明，CAPE使Hep3B癌细胞对TRAIL介导的细胞毒性更敏感[31]。CAPE与TRAIL(CAPE/TRAIL)联合治疗肝细胞癌发现，凋亡细胞和膜联蛋白-V(+)细胞的百分比显著增加；而使用泛胱天蛋白酶抑制剂可减弱CAPE/TRAIL诱导的细胞凋亡，表明联合治疗可引发胱天蛋白酶依赖性细胞凋亡[31]。此外，CAPE可刺激死亡受体5表达，用死亡受体5/Fc嵌合体蛋白处理后明显阻断了CAPE/TRAIL诱导的细胞凋亡，表明CAPE/TRAIL通过TRAIL与死亡受体5结合刺激细胞凋亡[31]。同时，CHOP的表达受CAPE的刺激显著增加，且CHOP的瞬时敲低消除了CAPE/TRAIL介导的细胞凋亡[31]。这些结果表明，CHOP是CAPE/TRAIL介导的细胞凋亡的关键调节因子，同时提示CAPE在肝细胞癌的化学预防中具有协同作用，并具有潜在应用前景。

2.7结直肠癌(colorectal cancer，CRC) CRC是全球第三大常见癌症[32]。虽然通过早期检测和治疗可降低CRC的病死率，但患者的存活率仍较低。β联蛋白表达的激活在CRC早期阶段有重要意义,CAPE可影响HCT116和SW480中β联蛋白相关信号通路，其以剂量和时间依赖性方式对两种细胞株的生长有强烈抑制作用[33-34]。流式细胞术分析显示，SW480细胞暴露于CAPE后，G0/G1期细胞比例增加，S期细胞比例下降，细胞凋亡率增加，用CAPE预处理后，β联蛋白的表达明显被抑制[33-34]。提示CAPE具有治疗CRC的潜力。 异常的PI3K/Akt通路已被证明是包括CRC在内的多种癌症发生的主要途径。有学者研究了CAPE在体内外对人CRC细胞的抑制作用及相关信号通路，结果显示，CAPE通过诱导G0/G1细胞周期停滞和细胞凋亡途径而抑制CRC细胞的增殖[35]。在小鼠异种移植模型中，CAPE显著抑制了CRC的生长[35]。此外，CAPE在体外和体内通过调节PI3K/Akt、AMP活化的蛋白激酶和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号转导途径而充当人CRC的化学预防剂[35]。

2.8胆管癌 胆管癌是胆管上皮的恶性肿瘤，近年其发病率和死亡率逐渐升高，目前已跃居为第二种最常见的原发性肝癌，占所有胃肠道恶性肿瘤的3%[36]。Onori等[37]评估了体内外CAPE对胆管癌生长的影响，结果显示，CAPE通过改变凋亡信号转导途径抑制NF-κB DNA结合活性和大部分胆管癌细胞系的生长，同时抑制p50和p65蛋白的表达，证实CAPE可能在转录和转录后水平抑制胆管癌的生长。

CAPE是否抑制细胞周期是由BrdU染色和检测胆管癌细胞中增殖细胞核抗原蛋白的表达来评估。与对照组相比，实验组观察到细胞周期受CAPE诱导停滞[37]。采用Annexin-V染色和免疫印迹实验可观察到胆管癌细胞系中大部分细胞死亡，用CAPE体外处理胆管癌细胞可观察到抗凋亡标志物Bcl-2表达减少，促凋亡标志物Bcl-2相关X蛋白显著增加，证实CAPE具有抗胆管癌细胞的作用[37]。在体内研究中，CAPE抑制肿瘤生长的同时延长了肿瘤潜伏期[37]。在肿瘤样品中，CAPE导致胆管癌细胞凋亡。体内外实验均证明，CAPE增加了细胞凋亡，减少胆管癌细胞的生长。对其他器官(肺、心脏、肾、胃和肠)的评估显示，CAPE长期治疗无毒性或继发效应，且在整个研究中具有良好的耐受性[37]。该实验证明了CAPE在抗肿瘤方面具有良好的特异性，不良反应少，可作为一种潜在的抗癌药物在肿瘤治疗中发挥独特的功效。

2.9口腔癌及鼻咽癌 口腔癌是世界上最常见的10种癌症之一,而口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是最常见的口腔癌类型[38]。有学者研究了CAPE抗OSCC的分子机制，其中Akt信号通路转导活性的下调，Forkhead盒O1磷酸化、缺氧诱导因子-1α等已被证明有助于CAPE介导的对OSCC的抗肿瘤作用[39-41]。而另有研究发现，CAPE可通过磷酸化胞外信号调节激酶1/2激活MAPK信号通路，增加N-MYC下游调节基因(N-MYC down stream regulated gene,NDRG)1的表达，从而抑制OSCC细胞生长[42]。

NDRG属于细胞溶质蛋白家族，其作用涉及多种生理过程。NDRG1为NDRG家族的一员，属于肿瘤抑制基因。Kanda等[43]的研究证实，鼻咽癌患者中NDRG1的表达较少，而CAPE通过MAPK途径上调NDRG1的表达以减弱鼻咽癌细胞的增殖和侵袭[44]。在鼻咽癌细胞中，CAPE还可抑制信号转导及转录激活因子3(transductor and activator of transcription 3，STAT3)的活性。STAT3是一种转录因子，可调节参与实体瘤发展的多种基因的表达。STAT3的过表达和组成型活化参与了鼻咽癌的发生，而STAT3抑制剂抑制了肿瘤细胞的增殖和生长[44]。在该研究中，CAPE明显减少STAT3的磷酸化，并抑制STAT3的活性，从而抑制鼻咽癌细胞的生长[44]。

2.10黑素瘤 恶性黑素瘤是致死率最高的一种皮肤恶性肿瘤，目前已成为世界上发病率增长最快的恶性肿瘤之一,年增长率为3%～5%[45]。黑素瘤进展迅速，一旦发生转移很难治愈，5年生存率<20%[46]。目前黑素瘤尚缺乏有效的治疗手段，天然产物为其治疗提供了新思路。有研究探讨了CAPE作为抗黑素瘤药物在5种体外黑素瘤细胞系B16-F0、B16F10、SK-MEL-28、SK-MEL-5和MeWo以及在C57BL/6小鼠皮肤B16-F0黑素瘤肿瘤模型中的功效，结果表明，CAPE可抑制黑素瘤细胞，且10 mg/(kg·d)的CAPE抗黑素瘤效果最为显著[47]。Pramanik等[48]在前期研究中证实，CAPE可抑制黑素瘤细胞的生长，并诱导活性氧类物质的产生。体内研究发现，CAPE抑制小鼠中B16F0肿瘤异种移植物的生长，降低PI3K、Akt、哺乳运动需帕霉素靶蛋白以及X-连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)的磷酸化，并增强胱天蛋白酶3和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶的切割[48]。用CAPE处理B16F0和SK-MEL-28黑素瘤细胞，抑制了酪氨酸458处的PI3K、丝氨酸241处的PDPK1、丝氨酸2448处的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白以及丝氨酸473处的Akt的活化，此外CAPE还下调了XIAP、生存素及Bcl-2的表达[48]。用Akt转染细胞后，其过表达抑制了XIAP的减少，并阻断了CAPE介导的细胞凋亡，而XIAP的过表达进一步减少了CAPE诱导的细胞凋亡。综上可知，CAPE通过抑制PI3K/Akt/XIAP途径在体外和体内诱导黑素瘤细胞凋亡。

3 小 结

目前抗癌药物价格昂贵、毒性大、不良反应多，因此研究新的生物活性化合物具有重要意义。体内和体外研究均表明，CAPE是一种极具前途的药物，其作用于多种信号通路及分子靶点，具有抗肿瘤、抗炎、免疫调节等多种生物活性，且对正常细胞组织的影响小。CAPE良好的生物活性吸引了众多学者的关注，其具有广阔的应用前景。但CAPE抗肿瘤活性的作用机制尚不清楚，其对凋亡信号通路中的信号分子影响的研究较少。此外，还需进行单独或与现有治疗剂组合的临床试验来进一步验证CAPE的有效性，以期为CAPE在抗癌方面的应用提供理论依据。