石斛与粉葛体外体内降糖降脂协同作用研究

许子杨 敬思群 林映君 丁佳敏 周 扬 于白音

(1. 韶关学院英东食品科学与工程学院，广东 韶关 512005；2. 韶关学院英东生命科学学院，广东 韶关 512005)

医学营养疗法是糖尿病管理的一个重要组成部分[1]，而通过添加药食同源的中药营养的中药营养治疗已成为研究热点并在动物试验获得理想疗效[2-3]。铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)具有很高的药用价值[4]，其主要功能性成分包括石斛多糖、石斛碱、氨基酸、多肽类、酚类化合物和部分金属元素[5-6]，在所有活性成分中多糖含量是最高的(18%～30%)。多项研究表明，石斛具有降血糖[7-9]、降血脂[10-11]、抗肿瘤[12]、抗氧化[13-14]、提高免疫力[15]等作用。粉葛(PuerariathomsoniiBenth)为豆科多年生藤本植物，药用价值高，可促进人脑的血液循环、增强记忆、降低血脂血糖、减肥健美[16]，研究表明粉葛中的化学成分含有异黄酮、三萜类、淀粉及矿物元素等[17-19]，其中粉葛总黄酮具有改善2型糖尿病病人胰岛素抵抗的作用[20]。火山粉葛是中国国家地理标志产品，丹霞铁皮石斛是中国铁皮石斛中的名贵优质品种，仅分布于粤北丹霞地貌岩石上，韶关石斛产业逐步成为粤北地区的特色产业。

咀嚼片是一种服用方便、疗效显著的制剂形式，经咀嚼后崩解时间大大节省，溶解度高，生物利用度也较高。但关于将石斛和粉葛复合研制咀嚼片尚未见报道，也未见关于石斛、粉葛及其食品的系统的体外体内协同降糖降脂作用研究。有报道[21]表明，石斛、葛根配伍无“十九畏”和“十八反”等配伍禁忌。

试验拟在前人[22-24]研究的基础上建立高糖、高脂果蝇模型，以海藻糖、甘油三酯、总蛋白含量为考察指标，评价石斛与粉葛体内的降糖降脂作用协同作用，为进一步的机制研究提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

乙醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

石斛粉葛咀嚼片：实验室自制[25]；

α-葡萄糖苷酶(来源于黑曲霉)： S10050-1ku， 活力≥50 Units/mg Protein，上海源叶生物科技有限公司；

对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)：含量>98%，上海宝曼生物科技有限公司；

阿卡波糖：拜耳医药保健有限公司；

盐酸二甲双胍片：齐鲁制药有限公司；

甘油三酯测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；

总蛋白定量测试盒：武汉博士德生物工程有限公司；

海藻糖测定试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；

蔗糖、琼脂、玉米粉、酵母粉、蔗糖和棕榈酸等：市售；

黑檀体果蝇：中山大学细胞生物学与遗传实验室；

普通培养基配方：蒸馏水1 L，酵母25.000 g，玉米粉67.050 g，大豆粉9.180 g，琼脂粉6.000 g，蔗糖40.000 g，麦芽糖42.400 g，对羟基苯甲酸甲酯0.25 mL，无水乙醇2.50 mL，丙酸6.875 g；

高糖培养基配方：普通培养基添加20%的蔗糖；

高脂培养基配方：普通培养基添加20%的棕榈烯酸。

1.1.2 仪器设备

全波长多功能酶标分析仪：SHE-3000G型，北京塞尔福知心科技有限公司；

智能光照培养箱：GZ-250-GII型，韶关广智科技设备有限公司；

台式高速冷冻离心机：H1650R型，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；

双人单面净化工作：SW CJ-2G型，苏州博莱尔净化设备有限公司；

体视显微镜：PXS-210型，梧州奥卡光学仪器有限公司。

1.2 样品制备

1.2.1 石斛粉葛咀嚼片 以丹霞铁皮石斛、火山粉葛为原料，以玉米淀粉、菊粉、甘露醇、木糖醇为辅料，经配料、制软材、湿法造粒、干燥、整粒、压片、包装等工序制作而成。最佳工艺配方为[25]：原料中石斛∶粉葛为1∶4，原辅料比[(石斛+粉葛)∶辅料(玉米淀粉+菊粉+木糖醇+甘露醇)]为2∶3，辅料配比(玉米淀粉∶菊粉∶木糖醇∶甘露醇)为4∶3∶1∶1，润湿剂60%乙醇的添加量为0.4 mL/g，硬脂酸镁1.5%。

1.2.2 醇提液的制备 将咀嚼片粉碎，过40目筛，称量10 g样品按粉液比1∶20 (g/mL)，用70%乙醇在90 ℃条件下回流提取3 h。将提取液抽滤，分别旋蒸至溶液体积<100 mL，使用乙醇定容至100 mL容量瓶中，即得0.1 g/mL 咀嚼片醇提液，备用。

1.2.3 水提液的制备 称量10 g样品按粉液比1∶10 (g/mL)，用蒸馏水回流提取3 h。将提取液抽滤，分别旋蒸至溶液体积<100 mL，用蒸馏水定容至100 mL 容量瓶中，即得0.1 g/mL咀嚼片水提液，备用。

1.2.4 阿卡波糖溶液的制备 准确称取5 g阿卡波糖，放入烧杯中用蒸馏水溶解，定容于50 mL容量瓶备用。

1.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性

以阿卡波糖为对照。参照蒋莺[26]的方法(PNPG法)进行。将反应液置于酶标仪405 nm下测定吸光度，每个样品同时做3个平行试验。酶活性抑制率按式(1)计算：

(1)

式中：

R——酶活性抑制率，%；

A空白——不加待测样品反应后的吸收值；

A样品——加入待测样品反应后的吸收值；

A背景——只加待测样品的吸收值。

1.4 果蝇降糖降脂试验

参照段寅慧[27]的方法进行。果蝇分为正常对照组、模型组、阳性对照组和给药组，以盐酸二甲双胍为阳性对照。给药组又分为石斛组、粉葛组、石斛粉葛组。各组配方见表1。

将培养3 d的雄性果蝇随机分组，正常对照组喂养普通培养基，随机挑选出的果蝇2型糖尿病模型喂养高糖培养基、高脂培养基7 d后，再随机分为模型组和咀嚼片给药组，给药组是指在培养基中分别加入石斛粉葛咀嚼片、粉葛咀嚼片、石斛咀嚼片，7 d后测定蛋白质、甘油三酯和海藻糖指标。果蝇模型试验分组详见表2。

表1 咀嚼片配方Table 1 Formula of chewable tablet

表2 果蝇模型试验分组Table 2 High glucose drosophila model experiment grouping

海藻糖、甘油三酯、总蛋白含量：按试剂盒方法进行测定。

1.5 数据统计与处理

试验数据以“X±S”表示，统计软件SPSS 22.0用于分析差异的意义，P<0.05，显著性差异；P<0.01，极显著性差异，每个试验做3个平行。

2 结果与分析

2.1 石斛粉葛咀嚼片对α-葡萄糖苷酶抑制能力

从图1可知，各组对α-葡萄糖苷酶抑制作用都呈剂量—效应关系。石斛咀嚼片水提液、粉葛咀嚼片水提液、石斛粉葛咀嚼片水提液与阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制活性强弱顺序为：阿卡波糖>石斛咀嚼片水提液>石斛粉葛咀嚼片水提液>粉葛咀嚼片水提液；石斛咀嚼片醇提液、粉葛咀嚼片醇提液、石斛粉葛咀嚼片醇提液对α-葡萄糖苷酶抑制活性强弱顺序为：阿卡波糖>粉葛咀嚼片>石斛粉葛咀嚼片醇提液>石斛咀嚼片醇提液。各组对α-葡萄糖苷酶抑制能力都呈剂量—效应关系。当浓度为5 mg/mL时，石斛粉葛咀嚼片水提液抑制率为28.55%，醇提液抑制率为21.60%，水提液的抑制能力略强于醇提液。综上，石斛粉葛咀嚼片有一定的α-葡萄糖苷酶活性抑制作用，但弱于阿卡波糖。

多糖是铁皮石斛最主要的化学成分，水溶性好[28]，粉葛中主要化学成分为葛根素、大豆苷元等异黄酮类化合物[29]，因此各组咀嚼片的水提液以石斛咀嚼片对α-葡萄糖苷酶抑制作用最强，而铁皮石斛乙醇提取物中成分众多，主要含有菲类化合物、联苄类、茐酮类、酚酸类、黄酮、生物碱、挥发油、微量元素等[30]，各组咀嚼片的醇提液以粉葛咀嚼片作用最强，可能是火山粉葛的醇溶性总黄酮含量高所致，有待进一步试验研究。

图1 α-葡萄糖苷酶抑制活性Figure 1 Effect of concentration of sample on inhibitory activity of α-glucosidase

协同作用分析：水提液对α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值由小到大的顺序为：石斛咀嚼片水提液<石斛粉葛咀嚼片水提液<粉葛咀嚼片水提液，以石斛咀嚼片作用最强，其次是石斛粉葛咀嚼片，粉葛咀嚼片抑制作用最弱；而醇提液对α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值由小到大的顺序为：粉葛咀嚼片醇提液<石斛粉葛咀嚼片醇提液<石斛咀嚼片醇提液，以粉葛咀嚼片作用最强，其次是石斛粉葛咀嚼片，石斛咀嚼片抑制作用最弱。因此，石斛与粉葛对α-葡萄糖苷酶抑制活性无显著的协同作用。

2.2 石斛粉葛咀嚼片对高糖诱导的果蝇2型糖尿病模型糖脂代谢的影响

由表3可知，高糖模型组与正常组相比，总蛋白含量有所降低，但无显著差别，无统计学意义(P>0.05)；甘油三酯含量升高极显著，有显著统计学意义(P<0.01)；海藻糖含量升高极明显，有明显统计学意义(P<0.01)。模型建立。给药后，(石斛+粉葛)咀嚼片组与高糖模型组相比，总蛋白含量无显著差别，无统计学意义(P>0.05)；甘油三酯含量和海藻糖含量均极明显降低，有明显统计学意义(P<0.01)。因此，石斛粉葛咀嚼片有一定的降血糖作用。

2.3 石斛粉葛咀嚼片对高脂诱导的果蝇2型糖尿病模型糖脂代谢的影响

由表4可知，高脂模型组与正常组相比，总蛋白含量有所降低，但无显著差别，无统计学意义(P>0.05)；甘油三酯含量升高极显著，有显著统计学意义(P<0.01)；海藻糖含量升高极显著，有显著统计学意义(P<0.01)，模型建立。给药后，(石斛+粉葛)组与高脂模型组相比，总蛋白含量有所升高，但无显著差别，无统计学意义(P>0.05)；甘油三酯含量降低极显著，有显著性差异(P<0.01)；海藻糖含量降低显著，有统计学意义(P<0.05)。因此，石斛粉葛咀嚼片有一定的降血脂作用。这源于铁皮石斛、粉葛异黄酮化合物及葛根素都有降血糖、降血脂的作用[31-33]。

表3高糖模型组果蝇的总蛋白质含量、甘油三酯含量、海藻糖含量†
Table 3 The total protein content,triglyceride content and trehalose content of hyperglycemia model group

组别总蛋白含量/(mg·mL-1)甘油三酯含量/(μg·mg-1)海藻糖含量/(mg·mL-1)正常组 3.62±0.210.28±0.022.44±0.03高糖模型组3.51±0.090.83±0.05∗∗5.81±0.16∗∗阳性对照组3.58±0.050.32±0.04##3.21±0.09##咀嚼片组 3.51±0.060.35±0.02##3.59±0.03##

† “*”表示与空白组比较P<0.05，“**”表示与空白组比较P<0.01；“#”表示与模型组比较P<0.05，“##”表示与模型组比较P<0.01。

2.4 石斛、粉葛协同降糖降脂作用

由表5可知：高糖组、高脂组中，皆以(石斛+粉葛)组降脂作用最强，其次是石斛组，最弱的是粉葛组，石斛与粉葛合用效果都优于各自单独使用效果，因此石斛与粉葛有体内协同降糖降脂作用。

体内试验表明，石斛和粉葛具有协同辅助降糖降血脂作用。石斛与粉葛在体外降糖试验中未显示协同降糖作用，但在体内试验中却显示有协同作用。

表4高脂模型组总蛋白质含量、甘油三酯含量、海藻糖含量†
Table 4 Total protein content,triglyceride content and trehalose content of high-fat model group

组别总蛋白含量/(mg·mL-1)甘油三酯含量/(μg·mg-1)海藻糖含量/(mg·mL-1)正常组 3.62±0.210.28±0.022.44±0.03高脂模型组3.50±0.061.57±0.09∗∗4.12±0.13∗∗阳性对照组3.60±0.020.44±0.11##2.85±0.10##咀嚼片组 3.93±0.040.59±0.03##3.56±0.01#

† “*”表示与空白组比较P<0.05，“**”表示与空白组比较P<0.01；“#”表示与模型组比较P<0.05，“##”表示与模型组比较P<0.01。

表5 石斛和粉葛协同降糖降脂作用分析(给药7 d后)Table 5 Analysis of hypoglycemic and lipid-lowering synergistic effects between Dendrobium and Pueraria thomsonii after 7 d medication

3 结论

各组咀嚼片的水提液、醇提液对α-葡萄糖苷酶抑制作用皆呈剂量效应关系。咀嚼片水提液以石斛咀嚼片作用最强，咀嚼片醇提液以粉葛咀嚼片抑制作用强，而水提液的抑制作用略强于醇提液，多糖是石斛的主要有效成分，醇溶性总黄酮是粉葛的主要有效成分，可以推测石斛体外降糖活性要强于火山粉葛；石斛组、粉葛组和(石斛+粉葛)组对高糖高脂诱导的果蝇模型的甘油三酯含量及海藻糖含量均有降低作用，但对蛋白质含量无显著影响，其中以(石斛+粉葛)组作用效果最佳，说明石斛和粉葛具有体内协同降糖降脂作用。

试验发现石斛和粉葛体外降糖作用与体内降糖作用不一致，与尹红力等[34]关于黑木耳多糖报道不一致，除了原料不同以外，更重要的是体内代谢通路可能存在一些调节因子在起作用，因此关于石斛和粉葛协同降糖降脂机制还有待进一步的研究。