超导量点—免疫荧光法快速测定粮食中黄曲霉毒素B1的方法验证

胡元斌 许艳霞 王达能 马 志 倪小英 唐颜苹 余 杨

(1. 湖南省粮油产品质量监测中心，湖南 长沙 410201；2. 深圳赛泰诺科技股份有限公司，广东 深圳 518000)

黄曲霉毒素B1是已知的化学物质中致癌性最强的一种，主要诱发肝癌，对人和动物均具有极强的危害性。食物黄曲霉毒素B1污染比较常见，花生、玉米、稻谷、小麦、花生油等粮油食品都极易受到污染，且以南方高温、高湿地区受污染最为严重[1]。

黄曲霉毒素B1的检测方法主要有仪器检测法[2-5]和免疫学检测法[6-8]。仪器检测法有高效液相色谱法、同位素稀释液相色谱—串联质谱法、薄层色谱法、毛细管电泳法，其中高效液相色谱法是目前实验室应用最广泛的方法[9-10]。仪器检测法特异性强、准确度高，但对操作人员技术要求高，前处理繁琐，难以实现大批量样品检测，且无法满足及时高效的市场监管需求。免疫学检测法主要是利用抗原抗体的特异性免疫反应对样品中的抗原或抗体进行定量、定性或定位检测，属于快速检测方法，与仪器检测法相比，该方法具有设备小巧、检测速度快、成本低等优点，在市场监管中具有广泛的应用，且适合大批量样品的检测。

根据标记物的不同，黄曲霉毒素B1免疫学检测法有酶联免疫法[11]、胶体金法[12]、时间分辨荧光法、荧光微球法、量子点法[13]等。量子点是一种准零维的纳米材料，具有激发光谱宽，发射光谱窄，荧光寿命长，斯托克位移大，荧光强度大，且可通过粒径控制荧光波长及强度等特点，是一种理想的荧光标记物，在生物成像、免疫检测等领域广泛应用[14]。

研究拟以超导量子点为荧光标记物，利用超导量点优越的荧光性能，结合免疫荧光技术，建立一种灵敏、准确的粮食黄曲霉毒素B1的快速检测方法，并对该方法的准确性、重复性和台间差等参数进行验证，旨在考察该方法在粮食黄曲霉毒素B1的快速检测的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

黄曲霉毒素B1快速定量检测卡：深圳市赛泰诺生物技术有限公司；

ST稀释液：深圳市赛泰诺生物技术有限公司；

黄曲霉毒素B1酶联免疫检测试剂盒：北京华安麦科生物技术有限公司；

黄曲霉毒素B1免疫亲和柱：北京中检维康生物技术有限公司；

甲醇：色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；

色谱柱：RBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，美国Agilent公司；

糙米、玉米样品：湖南家润多超市。

1.1.2 仪器

免疫荧光快速定量检测系统：QD-Infinity型，深圳市赛泰诺生物技术有限公司；

酶标仪：rayto RT-6000型，深圳雷杜生命科学股份有限公司；

液相色谱仪：Agilent 1100型，安捷伦科技有限公司。

1.2 样品检测

1.2.1 样品预处理 稻谷样品脱壳后粉碎至全部过20目筛，小麦和玉米直接粉碎至全部过20目筛，称取过筛样品5 g置容器中(如50 mL离心管)，加入60%甲醇溶液25 mL，混匀，置摇床震荡10 min，选择4 000×g离心5 min，取上清液备用。

1.2.2 超导量点—免疫荧光法快速法 取经预处理的样品上清液100 μL与ST缓冲液500 μL震荡混匀，得待检液1，取75 μL待检液1垂直缓慢滴入检测卡的加样孔，孵育15 min后，选择“快速检测”模式，当出现请插入检测卡提示时，立即将检测卡插入QD-Infinity快速免疫荧光分析仪，仪器自动根据检测卡上的二维码读取产品信息并进行检测，13 s仪器显示检测结果，检测完毕。

1.2.3 酶联免疫法 取经预处理的样品上清液，按照AFB1酶联免疫检测试剂盒的检测方法进行测试。

1.2.4 高效液相色谱法

(1) 上样液制备：取经预处理的样品上层清液10 mL，加入20 mL蒸馏水稀释于50 mL离心管中，涡旋混匀，再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液。

(2) 净化：免疫亲和柱平衡后，将柱上面连接25 mL一次性注射器，准确移取15 mL上样液，调节开关，使液体以1～2 d/s的速度流出；待液体排干后，用去离子水洗涤2次，每次10 mL；待液体排干后，上样1 mL甲醇，流速1 d/s，收集洗脱液，用水稀释定量至2 mL，最后用0.22 μm 微孔滤器过滤后转移至样品瓶采用柱后光化学衍生高效液相色谱法测量。

(3) 色谱条件：选择ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流动相A为水，B为甲醇，C为乙腈；等度洗脱(58% A+20% B+22% C)；流速1.2 mL/min；柱温30 ℃；进样体积100 μL；激发波长360 nm；发射波长440 nm；柱后光化学衍生器。

1.3 数据处理

所有数据均采用Excel 2010和SPSS 22.0处理。

2 结果与讨论

2.1 准确性

2.1.1 与酶联免疫法比较 酶联免疫法是当前应用较多的黄曲霉毒素B1的快速检测方法，也是国标(GB 5009.22—2016第四法)规定方法。随机选取43份不同黄曲霉毒素B1的样品，分别采用超导量点—免疫荧光法快速法和酶联免疫法测定，将两种测定方法的结果进行配对t检验、相关分析和方差分析，见表1。

由表1可知，43份样品的超导量点—免疫荧光法快速法和酶联免疫法检测结果平均值分别为10.84，11.47 μg/kg，两种方法配对检验t值为1.002，而在95%的置信度下，t分布的双边临界t值为2.326，因此，两种方法的检测结果之间无显著性差异。

分别采用偏相关和距离分析分析了超导量点—免疫荧光法快速法和酶联免疫法相关性(见表2)，偏相关结果表明，两种方法检测结果间的Pearson相关系数为0.965，表明两种方法在0.01水平(双侧)上显著相关。距离分析结果也表明两种方法的Pearson相关系数为0.965，表明两种方法的结果为相似矩阵。

表1 超导量点—免疫荧光法快速法与酶联免疫法t检验表Table 1 The t-test results of QD-Infinity and ELISA

表2 超导量点—免疫荧光法快速法与酶联免疫法偏相关分析†Table 2 The partial correlation analysis of QD-Infinity and ELISA (n=43)

† **. 在0.01水平(双侧)上显著相关。

对超导量点—免疫荧光法快速法和酶联免疫法的检测结果之间进行了线性相关拟合，结果表明，两种方法检测结果线性相关系数R2=0.930 6，线性方程斜率为0.906，与1接近。说明超导量点—免疫荧光法快速法和酶联免疫法的检测结果非常接近，无显著性差异。

假定方差齐性，采用S-N-K(s)比较方法，比较了两种检测方法结果之间的差异，结果见表3。结果表明，两组结果的F值为0.003，显著性为0.957，远大于0.05，表明两组结果无显著性差异。

2.1.2 与高效液相色谱法比较 高效液相色谱法是黄曲霉毒素B1检测的经典方法。随机选取25份不同黄曲霉毒素B1的样品，分别采用超导量点—免疫荧光法快速法和高效液相色谱法测定，将两种测定方法的结果进行配对t检验、相关分析和方差分析，见表4。

图1 超导量点—免疫荧光法快速法与酶联免疫法相关性Figure 1 The correlation of QD-Infinity and ELISA

表3 超导量点—免疫荧光法快速法与酶联免疫法方差分析Table 3 The variance analysis of QD-Infinity and ELISA

表4 超导量点—免疫荧光法快速法与高效液相色谱法t检验表Table 4 The t-test results of QD-Infinity and HPLC

由表4可知，25份样品的超导量点—免疫荧光法快速法和高效液相色谱法检测结果平均值分别为272.91，283.90 μg/kg，两种方法配对检验t值为0.849，而在95%的置信度下，t分布的双边临界t值为2.391，因此，两种方法的检测结果之间无显著性差异。

分别采用偏相关和距离分析分析了超导量点—免疫荧光法快速法和高效液相色谱法相关性(见表5)，偏相关结果表明，两种方法检测结果间的Pearson相关系数为0.990，表明两种方法在0.01水平(双侧)上显著相关。距离分析结果也表明两种方法的Pearson相关系数为0.990，表明两种方法的结果为相似矩阵。

对超导量点—免疫荧光法快速法和酶联免疫法的检测结果之间进行了线性相关拟合，结果表明，两种方法检测结果线性相关系数R2=0.980 8，线性方程斜率为1.089 9，与1接近，说明两种方法的检测结果非常接近，无显著性差异。

假定方差齐性，采用S-N-K(s)比较方法，比较了超导量点免疫荧光法和高效液相色谱法两种检测方法结果之间的差异，结果见表6。结果表明，两组结果的F值为0.010，显著性为0.920，远大于0.05，表明两组结果无显著性差异。

表5 超导量点—免疫荧光法快速法与高效液相色谱法偏相关分析†Table 5 The partial correlation analysis of QD-Infinity and HPLC (n=25)

† **. 在0.01水平(双侧)上显著相关。

2.2 重复性

随机选取1个样品，采用超导量点—免疫荧光法重复测定6次，结果分别为7.10，7.33，7.44，6.59，6.69，6.36 μg/kg，平均值为6.92 μg/kg，相对标准偏差为6.29%(低于10%)，表明该方法具有较好的重复性。

图2 超导量点—免疫荧光法快速法与高效液相色谱法相关性Figure 2 The correlation of QD-Infinity and HPLC

表6 超导量点—免疫荧光法快速法与高效液相色谱法方差分析Table 6 The variance analysis of QD-Infinity and HPLC

2.3 稳定性

随机选取3个不同浓度梯度(编号为a、b、c，对应浓度分别为3.72，23.31，9.95 μg/kg)的样品，采用超导量点—免疫荧光法快速法，每份样品分别孵育15，16，18，20 min 后，进行测定，考察孵育时间对检测结果的影响，结果见图3。由图3可看出，随着孵育时间的增长，测定结果逐渐升高。与15 min相比，a、b、c 3个样品孵育20 min 后，检测结果分别升高15.9%，17.8%，18.9%。

2.4 台间差

在随机两台QD-Infinity免疫荧光快速定量检测系统上对3个不同浓度梯度的样品(样品编号分别为1、2、3，浓度分别为5.1，20.4，37.1 μg/kg)进行检测，每个样本平行检测6次，测定结果采用配对t检验来比较2台仪器间是否存在显著性差异，经计算t=0.393，t0.025,17=2.458，t

图3 超导量点—免疫荧光法孵育时间的影响Figure 3 The influence of time for the results of QD-Infinity

表7 超导量点—免疫荧光法台间差结果Table 7 The differents equipments QD-Infinity

3 结论

超导量点—免疫荧光法是一种以超导量子点为荧光探针的免疫分析方法，具有灵敏、准确、快速等优点。通过与高效液相色谱法及酶联免疫吸附法比较，该方法测定粮食中的黄曲霉毒素B1具有较高的准确性和符合国标(GB 5009.22—2016)要求的精密度，任意两台仪器间的检测解结果也无显著性差异。该方法检测结果与孵育时间密切相关，随着孵育时间的延长，检测结果逐渐上升，因此，在使用过程中应严格控制孵育时间。超导量点—免疫荧光法测定粮食中黄曲霉毒素B1准确、高效，具有较高的应用前景。