破壁灵芝孢子粉联合他莫昔芬对人乳腺癌MCF-7细胞皮下移植瘤生长增殖的影响＊

钟志如，罗序亮，刘学艳，林兰，王琳，李志斌

(1.南昌大学第二附属医院乳腺外科，南昌330006；2.江西省共青城市人民医院外科，九江330401)

乳腺癌是全球女性发病率最高的癌症， 也是死亡率第一的癌症[1,2]。乳腺癌的内分泌治疗是雌激素受体阳性乳腺癌患者综合治疗的重要组成部分， 主要包括拮抗雌激素受体类药物， 他莫昔芬(Tamoxifen ，TAM)凭借其低毒、经济、效应作用持久成为ER+乳腺癌患者综合治疗的一线药物[3]。 目前中药作为乳腺癌辅助治疗手段之一越来越受到重视。灵芝为多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体，灵芝孢子粉是灵芝的生殖细胞，拥有灵芝全部的遗传活性物质，具有调节免疫和抗肿瘤等多种功能[4-6]。 多项研究显示，灵芝孢子粉能通过各种途径如诱导肿瘤细胞凋亡等达到治疗肿瘤的目的[7]，并且已有大量应用灵芝孢子粉治疗各种肿瘤的研究报道[8-10]。 本研究旨在观察破壁灵芝孢子粉联合他莫昔芬对人乳腺癌裸鼠移植瘤治疗效果。

1 材料与方法

1.1 材料 雌性BALB/c-nu 裸鼠共40 只，4-6 周龄，体重18-25g，从湖南斯莱克景达实验动物有限公司购入， 裸鼠生产许可证号：SCXK （湘）2013-0004，使用许可证号：SYXK（赣）2017-0002，在SPF条件下饲养于南昌乐悠生物科技有限公司。 人乳腺癌细胞株MCF-7 细胞由中科院上海细胞库提供。 实验中使用的破壁灵芝孢子粉，其经销方为北京万世堂中医科学研究院 （每100g 含粗多糖0.60g，批准文号：国食健字G20110430，卫生许可证号：鲁卫食证字（2007）第370000-000350 号）购买，性状为棕色细小粉末，实验时以生理盐水配制成悬浊液。 实验用乳腺癌内分泌治疗药物他莫昔芬（分子式：C26H29NO，CAS 登录号：10540-29-1，EINECS 登录号:234-118-0） 由南昌乐悠生物科技有限公司提供，为白色粉末，实验时用生理盐水配制成悬浊液。RPMI 1640 培养基、Trypsin-EDTA 胰酶等购自Solarbio 公司。 胎牛血清 （北美） 购自Gibco 公司。 湖南湘仪低速多管离心机TDZ5-WS（济南云鹏医疗器械有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和单细胞悬液的制备 细胞株MCF-7 复苏后置于含 10% 胎牛血清的RPMI 1640 培养基中， 在37℃、 含5% CO2的培养箱中培养，适时传代。 取对数生长期细胞， 经Trypsin-EDTA 胰酶消化后吹打成单细胞悬液，1000r/min离心5 min，用RPMI 1640 培养基重悬细胞并将细胞的浓度调至为2.5 ×107/ml,将细胞悬液装于5ml无菌ep 管中备用。

1.2.2 动物模型建立、 动物分组及给药方法 用1ml 注射器注射0. 2ml 的上述细胞悬浮液于每只裸鼠的右前肢肩胛部皮下。接种12 d 后，可见接种处微小隆起，并逐渐增大。 60 只裸鼠中有44 只出现肿块，接种成功率为73.3% 。 接种后2 周将44只移植瘤接种成功的裸鼠随机分成4 组， 每组11只。 分组完成后开始给各组小鼠用药，以灌胃的形式模拟口服给药： 破壁灵芝孢子粉组500mg/kg 灌胃，1 次/d；他莫昔芬组4.6mg/kg 灌胃，次/2d；破壁灵芝孢子粉与他莫昔芬组联合组同时给予破壁灵芝孢子粉和他莫昔芬 （浓度和给药方法同上）；对照组相同体积的生理盐水灌胃，1 次/d；连续21d。

1.2.3 观察裸鼠成瘤情况 用药后观察裸鼠的一般状况， 包括日常活动、精神状态、体重变化。 每3d用游标卡尺测量肿瘤的长径( a)和短径( b)，计算肿瘤体积( V),V =ab2 /2。 药物处理21d 后,脱颈椎处死裸鼠，完整剥离肿瘤， 并称量重量和测量瘤体的体积。计算抑制率: 抑制率= ( 1－实验组平均瘤重/对照组平均瘤重) ×100% 。 最后，将小鼠肿瘤使用10%多聚甲醛固定后，石蜡包埋，进行连续机械切片，厚度为4μm。

1.2.4 观察瘤体HE 染色 切片后的肿瘤组织分别利用HE 染色及免疫组化染色：四组肿瘤组织均经10%福尔马林固定、切片、酒精脱水后以石蜡包埋，二甲苯脱蜡、酒精至水、经过苏木精-伊红染色（HE染色），HE 染色后的切片在不同倍数的光镜下观察并描述和记录细胞改变情况。

1.2.5 观察瘤体免疫组化染色情况 四组标本均采用免疫组化二步法检测石蜡标本切片中的ER-α、ER-β、Ki-67 以及P53 四种指标的表达，抗体和试剂盒均购自南昌乐悠生物科技有限公司， 以已知乳腺癌阳性切片为阳性对照， 以PBS 代替一抗作阴性对照，染色步骤严格按照说明书进行。

免疫组化染色包括ER-α、ER-β、Ki-67 以及P53 四种指标， 观察并记录每一种指标的表达情况，并进行计算对比。判断标准如下：ER-α、ER-β、Ki-67 以及P53 阳性信号均分布于细胞核中，以出现黄色至棕色颗粒为阳性表现， 计算阳性细胞百分比，定量判定结果。

1.3 统计学方法 使用Prism 7.0 software (GraphPad, San Diego CA)进行数据分析。 结果以±sD 表示，P＜0.05 具有统计学意义。

2 结果

2.1 动物一般情况 用药前各组裸鼠体重差异无统计学意义( P＞0．05)。整个实验过程中所有裸鼠均活动良好，大小便及饮食正常，对外界刺激有良好的反应，无死亡。 破壁灵芝孢子粉组和联合组小鼠精神状态较对照组和他莫昔芬组更好。

图1 各组裸鼠（n=11）：对照组；破壁灵芝孢子粉组；他莫昔芬组；联合组（破壁灵芝孢子粉+他莫昔芬组）实验期间小鼠体重变化

2.2 裸鼠体内乳腺癌移植瘤生长的影响 用药前各组肿瘤体积无显著差异( P＞0．05)，每周测量肿瘤体积2 次以动态观察肿瘤生长情况， 用药后对照组移植瘤体积进行性增大， 而他莫昔芬和灵芝孢子粉组移植瘤体积增大稍缓慢， 联合用药组增大尤其缓慢（图2）。 与对照组相比，各用药组移植瘤体积差异有统计学意义(P＜0.0001)，而联合用药组与单独用药组比较差异无统计学意义( P＞0．05)，单药组之间无显著差异( P＞0．05)。给药结束后将各组裸鼠安乐死，剥离裸鼠移植瘤（图2），对其移植瘤进行称重，比较各组平均瘤重，各实验组瘤重均低于对照组，其中破壁灵芝孢子粉+他莫昔芬组平均瘤重最低，具有统计学意义（P＜0.0001）。 计算并比较各组抑瘤率，其中破壁灵芝孢子粉+他莫昔芬组抑瘤率高于破壁灵芝孢子粉和他莫昔芬组（表1）。

2.3 各组瘤体组织形态学改变 将各组裸鼠移植瘤组织切片通过HE 染色光镜下可见对照组移植瘤细胞明显异型性：上皮排列失去极性，细胞核形态改变，大小不一，染色颜色较深，染色质纠结形成团块，图像中可见明显核仁，多见核分裂像。 破壁灵芝孢子粉组、 他莫昔芬组移植瘤细胞异型性较低， 出现红染无结构坏死区， 出现凋亡肿瘤细胞，联合组即破壁灵芝孢子粉+他莫昔芬组异型性最低，组织结构明显疏松，可见明显红染无结构的坏死区，其面积较另外三组明显增大，肿瘤细胞核深染、固缩、崩解，凋亡肿瘤细胞最多。 （图3）。

图2 各组裸鼠（n=11）：对照组；破壁灵芝孢子粉组；他莫昔芬组；联合组（破壁灵芝孢子粉+他莫昔芬组）移植瘤生长曲线（A）；各组裸鼠移植瘤重量对比（B）及移植瘤示意图（C）

表1 裸鼠移植瘤重量及抑瘤率

图3 各组裸鼠移植瘤切片HE 染色对比：A.对照组；B.破壁灵芝孢子粉组；C.他莫昔芬组；D.联合组（破壁灵芝孢子粉+他莫昔芬组）

2.4 各组免疫组化测量ERα、ERβ、Ki-67 及P53的阳性表达情况 显微图像分析ERα 阳性信号分布于细胞核中，出现黄色至棕色为阳性表现，在实验组、灵芝组、他莫昔芬组、联合组胞核内均未见黄色颗粒，呈阴性表达（图4）。

显微图像分析ERβ 阳性信号以细胞核内出现淡黄色至棕黄色为阳性，在对照组、灵芝组、他莫昔芬组及联合组胞核内可见少量棕黄色颗粒，其中联合组ERβ 表达最低， 阳性率表达为17.14%，对照组ERβ 阳性表达为33.26%,灵芝组ERβ 阳性表达率为37.00%,而在他莫昔芬组之中为30.35%，四组差别无统计学差异（P=0.153>0.05）（图5）。

Ki-67 为细胞核内出现黄色至棕色为阳性，四组中胞核内均可见黄色至棕色颗粒， 其中对照组中Ki-67 阳性率表达为43.60%， 灵芝组为35.83%，他莫昔芬组为37.14%，联合组Ki-67 阳性表达率为47.50%，4 组差别无统计学差异（P=0.136>0.05）（图6）。

P53 为细胞核内出现黄色至棕色为表达阳性，在对照组、灵芝组、他莫昔芬组及联合组胞核内可见淡黄色至棕黄色颗粒， 其中对照组P53 阳性率表达为84.17%， 灵芝组P53 阳性表达为90.77%，他莫昔芬组P53 阳性表达率为87.50%， 联合组P53 阳性表达率为66.67%， 该差别有意义 （P=0.006<0.05）（图7）。

3 讨论

图4 各组裸鼠移植瘤切片免疫组化ERα 对比：A.对照组；B.破壁灵芝孢子粉组；C.他莫昔芬组；D.联合组（破壁灵芝孢子粉+他莫昔芬组）

图5 各组裸鼠移植瘤切片免疫组化ERβ 对比：A.对照组；B.破壁灵芝孢子粉组；C.他莫昔芬组；D.联合组（破壁灵芝孢子粉+他莫昔芬组）

图6 各组Ki-67 对比：A.对照组；B.破壁灵芝孢子粉组；C.他莫昔芬组；D.联合组（破壁灵芝孢子粉+他莫昔芬组）

图7 各组裸鼠移植瘤切片免疫组化P53 对比：A.对照组；B.破壁灵芝孢子粉组；C.他莫昔芬组；D.联合组（破壁灵芝孢子粉+他莫昔芬组）

灵芝孢子是灵芝生长成熟期从菌盖弹射出来的象淡雾状的极其微小的孢子， 其主要成分有灵芝多糖、三萜类化合物、生物碱类、多肽及微量元素锌、锗、硒等，大量研究证明，灵芝孢子粉具有免疫抗肿瘤作用[11-14]、诱导细胞凋亡的作用[15]、抑制肿瘤血管生成[16,17]、 抑制肿瘤细胞的生长和转移[18]，GLS 抗肿瘤作用还可能与抑制TOPⅠ，TOPⅡ异构酶， 抑制肿瘤细胞端粒酶有关[19]。 本实验建立人乳腺癌MCF-7 细胞皮下移植瘤细胞模型，观察灵芝破壁孢子粉与他莫昔芬对乳腺癌移植瘤模型的影响。 本次研究结果显示，破壁灵芝孢子粉能够抑制人乳腺癌MCF-7 细胞的增殖，联合使用他莫昔芬对人乳腺癌MCF-7 细胞生长增值的抑制作用更加显著， 而这二者联合使用能够下调P53 蛋白的表达，进而继续影响乳腺癌预后，然而二者联合使用能够使P53 蛋白表达下调这一点并未在以往的实验中引起关注。

P53 是重要的抑癌基因， 包括野生型和突变型，研究证明，野生型P53 可 抑制细胞周期由G1期进入S 期，诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡，使细胞在新的周期复制或程序性细胞死亡中得到修复或恢复，从而抑制肿瘤的发生[20]。 由于野生型P53蛋白半衰期短，容易降解，所以检测出的都是是突变型P53 蛋白。 P53 抑癌基因的突变或P53 蛋白的过度表达都提示预后不良[21]。 研究表明，P53 肿瘤蛋白表达越高, 越有可能发生淋巴远处转移[22]。而本实验中正是对突变型P53 蛋白进行免疫组化检测证实,破壁灵芝孢子粉联合他莫昔芬可以显著降低P53 蛋白表达，提高乳腺癌的整体预后情况。

相比较于作为内分泌治疗首选用药的他莫昔芬容易耐药、副作用多等缺点，本研究中使用的破壁灵芝孢子粉作为中医药抗癌，具有价格低廉、副作用少、可接受度高、改善症状以及 调节免疫等优点。 应用中医药抗癌、预防癌症转移及改善恶性肿瘤预后，相对具有优势。 本实验验证破壁灵芝孢子粉具有一定抑制肿瘤生长作用的同时， 预测了内分泌治疗期间联合使用破壁灵芝孢子粉可能达到改善患者预后的作用。 有研究证明，经过放疗、化疗及手术的乳腺癌患者， 除却治疗本身带来的影响之外，还有可能会出现，诸如疲劳、疼痛、焦虑和抑郁的症状。 而灵芝孢子粉对于此类患者患者可能有益，而并未出现明显的不良反应[23]。 破壁灵芝孢子粉与他莫昔芬联合使用虽未明显的增加其抗肿瘤效果， 但能够显著降低肿瘤P53 的表达从而存在潜在的抗肿瘤转移效果。 破壁灵芝孢子粉的功效仍然是可以值得肯定的， 在临床治疗中也将会有更加广阔的应用前景。