原始卵泡激活与卵泡发育相关机制的研究进展

毛菁沁，冒韵东

原始卵泡激活和卵泡发育过程的异常信号调控将导致早发性卵巢功能不足（premature ovarian insufficient，POI）、卵泡生长迟缓、排卵障碍、卵母细胞质量下降等卵源性不孕事件发生。由于供卵来源有限，卵源性不孕是目前辅助生殖医学界面临的一大难题。因此，针对原始卵泡激活和卵泡发育相关机制的研究能使我们对卵源性不孕的原因有更加深入的了解，有利于提高卵泡发育异常、卵巢功能减退等疾病的临床诊治技术。本文就原始卵泡激活与卵泡发育过程相关信号通路的研究综述如下。

1 原始卵泡激活

卵泡是卵巢功能发挥的基本单位，卵泡储备池中原始卵泡的有序激活是雌性哺乳动物生育力维持的必要条件。目前针对卵泡激活较为经典的信号通路有磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B-FOXO3a/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K-AKT-FOXO3a/mTORc）通路和Hippo通路。

1.1 PTEN-PI3K-AKT-FOXO3a通路 PI3K是一种脂质激酶，在细胞增殖、代谢的调控上发挥关键作用。AKT是许多信号通路的交叉信号分子，对细胞生存、凋亡抑制起正性调控作用[1]。PTEN是在癌组织中突变频率较高的抑癌基因，对PI3K和AKT活性有抑制作用[2]。特异性敲除小鼠卵母细胞PTEN基因后对PI3K的抑制解除，诱导磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）转化为第二信使磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3）。随后，磷脂酰肌醇依赖性激酶1（phosphatidylinositol-dependent kinase1，PDK1）激活使AKT磷酸化，激活的AKT向核内转移使FOXO3a过度磷酸化（失活状态）并向核外转移[3]。FOXO3a是叉头转录因子家族成员，在细胞稳态维持和应激反应的调节中发挥核心作用[4]。原始卵泡激活研究中FOXO3a通过核-胞浆穿梭作用调控原始卵泡激活与休眠[2]。当PTEN保持高活性时，核内FOXO3a保持低磷酸化水平（活性状态），活化的FOXO3a促进细胞周期抑制因子表达，如细胞周期依赖性激酶抑制子（cyclin-dependent kinase inhibitor 1b，Cdkn1b/p27Kip1），而当过度磷酸化的FOXO3a核外转出时其对卵母细胞核的抑制作用解除，原始卵泡被激活[3]。综上提示PTEN与FOXO3a可抑制原始卵泡激活，避免大量休眠期卵泡同时进入生长阶段，防止卵泡过早过度消耗，是维持雌性哺乳动物正常生育年限的重要调节因子。

1.2 Kit/KitL-PI3K-AKT-TSC1/2-mTORc通路mTORc是丝/苏氨酸激酶复合体，具有促进蛋白合成，调节细胞生长、增殖的作用[5]。肿瘤抑制结节硬化复合物1/2（tumorsuppressortuberoussclerosiscomplex1/2，TSC1/2）是mTOR上游抑制因子[5]。酪氨酸激酶受体（receptor tyrosine kinase，Kit）是卵母细胞表面的跨膜蛋白，在前体颗粒细胞（pregranulosa cell）来源的Kit配体（KitL）作用下能够激活PI3K-AKT通路，磷酸化的AKT抑制TSC1/2活性从而解除其对mTORc的抑制作用[6]。4E结合蛋白（4E-binding protein，4EBP）是真核生物转录启动子，活化后能促进蛋白合成。P70S6K是细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、细胞周期依赖性激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）的正性调控因子，参与调控细胞周期启动和激活[5]。mTORc作用于下游靶点蛋白4EBP和P70S6K后使原始卵泡激活。综上，在原始卵泡激活事件中，前体颗粒细胞来源的信号分子（KitL）激活卵母细胞表面相应受体（Kit），进而启动卵母细胞生长的信号通路。提示在原始卵泡激活过程中颗粒细胞与卵母细胞之间的信号交换使卵泡各组成部分同步发育。

1.3 Hippo信号通路 Hippo信号通路是在组织再生、机体发育过程中对组织器官大小起严格限制作用的保守信号通路[7]。癌蛋白（YAP/TAZ）信号激活后将导致细胞内生长因子表达增加（如：结缔组织生长因子）进而促进细胞增殖。Hippo信号通路磷酸化YAP/TAZ使之失活，从而抑制组织过度生长维持器官正常大小[8]。有研究表明机械应力可以触发Hippo信号通路的激活。将卵巢组织切成小块时卵巢细胞之间的张力改变，细胞内骨架蛋白Actin由单体聚合为多聚体，而这个过程将导致Hippo信号通路异常，失去对癌蛋白YAP/TAZ信号的抑制作用，去磷酸化的YAP/TAZ进入核内与转录因子TEAD结合后促进生长因子表达，加快细胞增殖与生长[8]。原始卵泡激活后形态学表现为卵母细胞增大，单层扁平前体颗粒细胞转变为复层立方颗粒细胞，这个转变会使卵泡体积增大，增加卵巢组织内的机械应力进而触发Hippo信号通路，抑制原始卵泡激活和卵泡生长[9]。因此，在卵巢中卵泡激活导致的形态学改变通过机械应力触发Hippo信号通路，抑制原始卵泡激活，对卵泡储备维持发挥重要作用。

1.4 其他调节因子参与原始卵泡激活调控 动物实验中发现叉头转录因子家族成员FOXL2促进前体颗粒细胞向立方形颗粒细胞分化并参与次级卵泡形成[6]。人类颗粒细胞中FOXL2转录水平的研究结果显示：相比于原始卵泡，初级卵泡颗粒细胞内FOXL2表达明显下降，提示FOXL2可能参与抑制原始卵泡激活[10]。新生儿卵巢同源盒蛋白（newborn ovary homeobox，NOBOX）是FOXL2的结合蛋白，参与调控卵母细胞特异性基因表达和卵泡发育。POI患者血液样本单细胞全外显子基因测序结果显示，NOBOX基因的截短突变与POI发生有关。NOBOX诱导细胞G2/M周期阻滞，当发生基因截短突变时这种阻滞作用丧失，可能是POI发生的原因之一[11]。LIM同源盒8（LIM homeobox 8，LHX8）是在原始卵泡激活研究中提及较多的转录因子。RNA结合蛋白LIN28A是PI3K-AKT-mTOR信号通路的上游激活子，LHX8抑制LIN28A活性，提示LHX8参与抑制原始卵泡激活[6]。人类原始卵泡过渡至初级卵泡的过程中卵母细胞LHX8表达下降，进一步提示LHX8对原始卵泡激活的负性调控[12]。Sirtuins是一组组蛋白去乙酰化酶，参与调控细胞能量代谢、衰老及炎症反应。SIRT1调节烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）代谢，在原始卵泡激活过程中卵母细胞SIRT1表达增加使NADH/NAD+比值下降，为后续卵母细胞糖代谢方式由糖酵解途径向氧化磷酸化途径的转变做准备，提示SIRT1参与卵母细胞激活[13]。SEMA6C（semaphorin6C）是一种分泌型蛋白，在神经细胞生长和突触形成过程中发挥作用，临床上参与阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease）的疾病发展进程。然而近期的实验结果发现该蛋白在卵巢细胞功能中发挥作用。当降调节新生小鼠卵巢细胞中SEMA6C表达水平后发现激活的原始卵泡数量显著增加，使用AKT抑制剂LY294002后又可以逆转这种现象。提示在小鼠卵巢中，SEMA6C可能通过抑制PI3K-AKT信号通路使原始卵泡保持休眠状态，在维持卵巢储备上有一定的作用[6]。

2 卵泡发育

不计其数的生物学事件的发生使卵泡发育得以正常进行，最后获得具有受精能力的次级卵母细胞，在受精后完成最后的减数分裂形成孕育新生命的受精卵。根据卵泡发育时对促性腺激素的反应性可以将之分为两个阶段：窦前卵泡发育和窦卵泡发育。限于文章篇幅本文主要阐述这两个阶段卵泡发育中较为显著的生物学事件。

2.1 窦前卵泡发育 原始卵泡激活后颗粒细胞增殖至双层时的卵泡称为次级卵泡。在次级卵泡向窦卵泡发育的过程中分化形成卵泡膜细胞。膜细胞根据其前体细胞来源可以分为内膜细胞和外膜细胞。内膜细胞由中肾管间充质细胞分化而来，具有合成分泌类固醇激素的作用；外膜细胞由卵巢髓质基质细胞分化而来，最终形成成纤维细胞、血管前平滑肌细胞和间质细胞，包裹于卵泡最外层起保护支持作用[14]。卵母细胞来源的生长分化因子9（growth differentiation factor 9，GDF-9）通过HH信号通路（hedgehog signaling pathway）参与调控膜细胞的分化过程。GDF-9作用于颗粒细胞促进HH通路的配体合成：DHH（desert hedgehog）与IHH（Indian hedgehog）[15]。DHH与IHH以旁分泌方式激活前体膜细胞表面的跨膜受体PTCH1/2，从而解除PTCH1/2对下游靶蛋白SMO的抑制作用[16]。活化的SMO激活前体膜细胞的分子标志物胶质瘤相关癌基因同源物（glioma-associated oncogene homolog，GLI），最终促使膜细胞分化形成[16]。窦前卵泡发育形成卵泡膜细胞是性激素合成的必要条件。

2.2 窦卵泡发育 当卵泡发育至直径5～9 mm时出现窦腔，使卵泡内颗粒细胞从空间分布上分隔成有功能差异的两个亚细胞群：卵丘颗粒细胞（cumulus，CC）和壁层颗粒细胞（mural granulosa cell，mGC）。CC是在解剖位置上与卵母细胞最接近的体细胞，其胞质变形延伸形成伪足样跨透明带结构（transzonal projection，TZP），缝隙连接（gap junction）位于TZP终端，与卵母细胞膜直接接触[17]。TZP是卵母细胞与CC实现信号双向沟通的结构基础。卵母细胞来源的信号分子通过TZP调节颗粒细胞分化增殖。CC通过TZP结构向卵母细胞输送代谢底物（如丙酮酸、氨基酸、类固醇等），在维持卵母细胞的物质代谢稳态的同时也参与抑制卵母细胞减数分裂阻滞。

卵母细胞减数分裂恢复是卵母细胞核成熟的标志。排卵前高浓度环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）是维持卵母细胞减数分裂阻滞的关键信号分子[18]。小鼠实验研究发现，出现黄体生成激素（luteinizing hormone，LH）峰之前，mGC来源的C型利钠肽前体（natriuretic peptide precursor type C，NPPC） 激 活CC 表 面 受 体 尿 钠 肽 受 体2（natriuretic peptide receptor 2，NPR2），促进环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP） 合成，cGMP通过TZP结构进入卵母细胞，抑制磷酸二酯酶3A（phosphodiesterase 3A，PDE3A）活性使其无法水解cAMP[18-19]。卵母细胞内高浓度cAMP激活蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）使细胞周期依赖性激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）处于高度磷酸化状态（失活状态）无法激活成熟促进因子（mature promoting factor，MPF）[20]，此时卵母细胞处于生发泡期（germinal vesicle，GV）。当LH峰来临，LH结合mGC表面LHR，释放表皮调节素（epiregulin，EREG）。EREG激活CC、mGC表面受体后下调细胞间缝隙连接[21-22]。同时，LH峰使CC表面NPR2去磷酸化（失活状态）使cGMP合成受到明显抑制[23]。在缝隙连接表达下调和cGMP合成减少的双重抑制下，卵母细胞内cGMP水平显著下降使PDE3A的抑制解除，发挥对cAMP水解作用后cAMP浓度快速下降，进而激活MPF，恢复卵母细胞减数分裂。

卵母细胞减数分裂恢复伴随的细胞形态学变化是胞内生发泡破裂（germinal vesicle breakdown GVBD），染色质浓缩形成同源染色体后在纺锤体的作用下排列于赤道板。在纺锤丝的牵引下同源染色体分离，第一极体排出象征着卵母细胞核发育成熟具备受精能力。至此，完整的卵泡发育过程结束，卵冠丘复合体从排卵孔中排出后在输卵管内等待受精，开始新一轮的生命循环。

3 结语

原始卵泡的有序激活是雌性哺乳动物出生后卵泡池中数量有限的卵泡储备能够维持数年甚至数十年生育年限的前提条件。原始卵泡过度激活则会出现POI、卵巢过度刺激等现象，过度抑制则会导致卵泡始终保持休眠状态直至闭锁，临床上表现为原发性不孕。卵母细胞内外源性的信号分子保持动态平衡使原始卵泡激活的信号通路正常进行。卵泡发育期，卵母细胞源性的信号分子参与调节膜细胞分化，LH峰诱发的信号通路对卵母细胞核的成熟极为重要，促使卵母细胞恢复减数分裂具备受精能力。子宫内膜异位症患者LH激素水平异常可能是其卵母细胞质量下降的原因之一[24]。综上，原始卵泡激活和卵泡发育过程信号通路的研究将为卵源性不孕提供新的诊治思路。