神经干细胞在脊髓损伤修复机制中的实验研究进展

岳倩文 综述 夏铂 审校

(宁夏医科大学中医学院，宁夏 银川 750004)

脊髓损伤严重损害患者的脊髓结构及功能，引起其运动、感觉以及自主神经功能障碍或丧失，临床上治疗难度较大，且预后不良[1]。脊髓损伤后神经修复的作用机制目前尚不明确，当前研究热点主要集中在脊髓损伤后神经干细胞的移植及其替代治疗上，鉴于此作者从神经干细胞入手，探讨脊髓损伤神经修复领域的实验研究现状。

1 神经干细胞

神经干细胞主要位于侧脑室下区(SVZ)和海马齿状回颗粒下区 (SGZ)[2]。研究[3]发现神经干细胞具有自我复制和多向分化潜能，并总结出神经干细胞(NSCs)是中枢神经系统内处于未分化状态能够自我更新复制，分化为神经元细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力，能自我更新，通过不对称分裂产生除自身以外的其他细胞，并足以提供大量脑组织细胞的干细胞。通常所说的神经干细胞是中枢神经系统中的干细胞，按照部位分类分为中枢神经干细胞(CNS-SC)和外周神经干细胞(PNSC)又称神经嵴干细胞(NCSC)。根据细胞来源神经干细胞可分为：胚胎干细胞(ESC)、成体神经干细胞(ASC)、胚体神经干细胞(FSC)。

ASC可从自身获得是最适合的供体，但因分化能力有使得ASC的应用范围受到限制。人的脊髓内存在神经干细胞，在脊髓损伤后患者会出现遗留截瘫，排便障碍、感觉障碍等后遗症。神经干细胞在研究神经发育及中枢神经系统移植和替代治疗起着重要作用，中枢神经系统的干细胞具有再生成神经元和胶质细胞的潜能，但神经干细胞的分裂、增生活动需要能量支持，按照调节因素可分为内源性和外源性[4]。

1.1内源性神经干细胞 内源性神经干细胞可以避免不良的免疫反应，避免了移植细胞阶段存在的伦理道德问题。当实验采用轻度脊髓损伤的大鼠模型探索脊髓损伤后神经干细胞增殖分化情况时发现脊髓损伤后大鼠脊髓背侧出现出血灶，病灶周围星状细胞的树突变厚和变宽并逐步形成胶质瘢痕。经DAPI染色后位于中央管的内源性神经干细胞会出现增殖，脊髓中央管内源性神经干细胞在轻度脊髓损伤后分化为神经元和星形胶质细胞，提示大鼠中的轻度脊髓损伤足以诱导内源性神经干细胞增殖和分化[5]。研究[6]表明，内源性神经干细胞广泛增殖以应对脊髓损伤情况。脊髓损伤发生后首先破坏血管系统，造成缺氧，但缺氧有利于胶质细胞扩张，随后细胞因子和生长因子的分泌，激活内源性神经干细胞，促进增殖[7]。

1.2外源性神经干细胞 Y.Zhao[8]发现支架的植入增加了神经元分化，减少了星形胶质细胞的分化，阻止了髓鞘对神经元分化的抑制，从而促进神经元传递及运动功能的恢复。但外源性神经干细胞的脆弱性，无法增殖分化为神经元的局限性，决定了其不能成为神经干细胞移植的理想细胞来源。在严重的脊髓损伤中，仅有小部分外源性神经干细胞分化为神经元而大多数分化为星形胶质细胞[9]。

2 神经干细胞与脊髓损伤修复

对于神经干细胞来说，细胞因子及其所在微环境是影响神经干细胞增殖、分化的因素，神经营养因子缺乏会导致脊髓再生障碍，而神经干细胞能否再生为新的神经元或轴突能否再生很大程度上取决于其中枢神经系统所在的微环境。通过中和表皮生长因子受体来改变这种不利的微环境信号传导可能在损伤部位诱导出更多的神经元，加速脊髓功能恢复。X.Li[6]将植入西妥昔单抗修饰的线性有序胶原支架(locs)进入犬脊髓损伤部位，西妥昔单抗作为一种表皮生长因子受体信号的拮抗剂，在增殖的神经干细胞中表皮生长因子受体信号被大量激活并产生新的神经元。

2.1神经干细胞的微环境 神经干细胞的微环境主要包括:神经干细胞相邻的支持细胞、细胞因子、细胞外基质和微血管网。脊髓损伤后微环境遭到破坏会相继出现炎症反应、微循环障碍、轴突断裂、细胞凋亡等过程[10]。脊髓神经干细胞从静止到增殖的转变与脊髓损伤后微环境的变化有关。脊髓损伤所形成的炎性微环境会使其向星形胶质细胞分化而限制其向神经元分化。脊髓损伤后产生IL-1、IL-6等神经毒性物质[11]，使得神经干细胞死亡或分化为星形胶质细胞，形成抑制轴突再生的不利微环境，可能是影响脊髓损伤后神经修复的关键因素。在严重的脊髓损伤发生后，其缺乏所必需的神经营养因子及不利于神经修复的微环境，使神经网络中只有一小部分神经干细胞衍生的神经元能够存活并分化成脊髓损伤移植部位的神经元[6]。

神经干细胞除了分化为神经元细胞还分化成星形胶质细胞，星形胶质细胞后期会形成致密的胶质瘢痕，对损伤突起再生有机械性阻碍作用。Y.Liu[12]发现位于中央管的内源性神经干细胞在脊髓损伤后具有分化为星形细胞而非神经元的趋势。但有研究[13]发现神经胶质瘢痕并非一无是处，其可能支持中枢神经系统轴突再生。王珊等[14]认为哺乳动物的中枢神经系统损伤后，所形成致密的瘢痕组织会封锁伤口从而保护神经系统免受进一步破坏，这提示神经干细胞可以起到保护受损脊髓的作用。M.Stenudd[15]证明脊髓损伤后神经干细胞衍生的瘢痕成分可以限制脊髓损伤后的组织损伤和神经损失，该发现将内源性神经干细胞鉴定为治疗脊髓损伤的潜在治疗靶标。故星形胶质细胞在神经元存活、神经突触形成及神经元反馈调节中起到关键作用[3]。

2.2神经营养因子/生长因子 脊髓损伤后神经营养因子/生长因子可以保护受损神经元，使损伤的细胞得到修复。神经干细胞可以分泌多种神经营养因子，如睫状神经营养因子(CNTF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素-3(NT-3)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)等。

BDNF是一种光谱的神经营养因子，可刺激诱导轴突再生抑制神经细胞凋亡。宋昭君[16]采用载BDNF基因的阳离子超声微泡(BDNF/CNBs)联合超声靶向破裂技术(UTMD)治疗大鼠脊髓损伤，使大鼠神经功能的恢复。NT-3可以促进少突胶质细胞的增殖及再生轴突的髓鞘化，促进神经元的分化、生长、存活。VEGF是一种多功能生长因子，参与神经系统中轴突的生长及成熟的过程[17]。从幼鼠的脊髓组织中分离出细胞，在悬浮液中以不同浓度的VEGF的培养，发现20 ng/mL VEGF诱导增长最快，然后EdU标记来评估神经球中的细胞增殖，细胞周期蛋白D1显著升高，VEGF可以在体外促进脊髓神经干细胞的增殖[18]。脊髓损伤后所形成的缺氧条件及细胞因子和生长因子的分泌有助于神经干细胞的增殖。与正常神经干细胞移植组相比，移植了VNSC的大鼠的运动神经元密度高45%，增加神经营养因子的释放并降低TRPV1的表达，阻断TRPV1受体可以减轻疼痛。VEGF-NSC转基因移植导致增强的神经元和运动功能的修复。VEGF诱导的神经干细胞恢复脊髓损伤后神经元的损失，促进神经营养因子的释放[19]。

神经干细胞对不同种类、不同浓度的因子及多种因子的联合应用的作用不近相同。F.Liu等[20]实验表明NGF 、BDNF是维持和分化发育神经元的关键，其中NGF在一定条件下可诱导轴突生长，对交感神经和感觉神经元的存活和维持至关重要。与单独的BDNF或NGF作用相比，联合BDNF和NGF治疗诱导更多神经元。I.U.Khan[21]将BDNF和血红素氧合酶-1(HO-1)表达的间充质干细胞(MSCs)注射到脊髓损伤的犬上，联合治疗组显示犬的后肢功能显着改善，炎症细胞因子如肿瘤坏死因子-α，白细胞介素-6，环氧合酶-2的表达减少以及星形胶质细胞减少，脊髓损伤犬的鞘内注射HO-1-MSCs后功能恢复得到改善。相较于HO1-MSCs或BNDF-MSCs组的治疗， HO-1和BNDF-MSCs的共同移植治疗更能有效的促进脊髓损伤后神经的修复。脊髓损伤后外源性NGF虽然具有神经再生修复作用,但对损伤局部再生也存在着抑制作用。

由此可见，不同的神经营养因子联合作用更能改善细胞外环境，促进感觉和运动神经元轴突生长，抑制神经元凋亡的作用。

2.3神经干细胞的治疗的实验研究 神经干细胞移植不仅能取代损伤坏死神经元，实现轴突的髓鞘再生或分泌神经营养因子，还可以改善损伤区域的微环境，抑制炎性反应及瘢痕组织形成，起到保护神经元的作用[22]。含有神经干细胞和各种生长因子的纤维蛋白基质的移植显著增强了脊髓损伤模型中的移植物存活率，并且移植物衍生的神经元因此获得了长距离轴突生长并部分恢复了破坏的神经回路，增强神经营养因子分泌，抗氧化，抗炎和抗凋亡，促进神经再生[23]。

神经干细胞移植替代坏死神经元成为实验研究治疗脊髓损伤的方法之一。K.Z.Lee[24]在研究证实啮齿动物移植的神经干细胞的神经元分化可使神经干细胞部分恢复。有研究[25]将脊髓损伤小鼠的神经干细胞移植到受损脊髓中，随后进行中性粒细胞和巨噬细胞的免疫荧光染色和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，白细胞介素-1β(IL-1β)，白细胞介素-6(IL-6)的mRNA水平检测，发现NSC移植可通过减少M1巨噬细胞活化和浸润中性粒细胞来调节脊髓损伤诱导的炎症反应并增强脊髓损伤后的神经功能。临床上可用于缓解继发性脊髓损伤的米诺环素长期服用存在毒性，X.J.Wang[26]开发的基于聚唾液酸(PSA)的米诺环素负载纳米药物输送系统(PSM)在脊髓损伤的大鼠上进行实验，发现可改善大鼠的运动功能，减少神经胶质瘢痕的形成，从而促进神经元的再生和长轴突在整个神经胶质瘢痕中延伸，保护神经元和髓鞘免受损伤。

以生物工程材料为代表的神经支架可以填补缺陷并重现细胞外基质的复杂结构成为替代材料首选。胶原支架具有良好的生物相容性和生物降解性，B.Fan等[27]将支架植入脊髓损伤大鼠病变区发现其可以减少疤痕沉积，促进神经生成，促进大鼠运动恢复。使用iPSC-NP治疗急性脊髓损伤对脊髓再生中涉及的大多数研究因素产生了积极的影响，如神经胶质瘢痕形成，轴突发芽，组织保留和细胞因子水平。将iPSC-NP-LHM细胞—聚合物构建体植入慢性脊髓损伤导致材料整合到受损脊髓中，影响桥接腔中内源组织元素的浸润，而且还增加受损区域以及周围宿主组织中TH+轴突的萌发。iPSC-NPs在支架中存活，影响了内源TH+神经元的数量与星形胶质细胞紧密连通[28]。在细胞替代的探索中，N.Chen[29]将亮氨酸重复序列和免疫球蛋白结构域的蛋白LINGO-1RNA移植到脊髓损伤大鼠模型上，结果发现LINGO-1 RNA处理的大鼠神经干细胞移植增加。

尽管神经干细胞移植对脊髓损伤治疗有很大的希望，但为了在功能上重建受损的神经回路，有必要将细胞替代疗法与其他治疗策略(鸡尾酒疗法)相结合。轴突再生是脊髓损伤修复的前提，有研究[30]将表达绿色荧光蛋白的神经干细胞包埋于含生长因子鸡尾酒的纤维蛋白基质中，移植至脊髓损伤部位，发现其可以延伸出大量轴突。用纤维蛋白改变病变微环境后嵌入生长因子鸡尾酒的矩阵观察到移植的神经干细胞分化成多种类型的神经元，最终可促进严重脊髓损伤大鼠的运动功能改善。

3 小 结

脊髓损伤可导致轴突断裂和神经元死亡，造成患者的永久性功能障碍。尽管神经干细胞的移植、替代及生物支架在脊髓损伤修复领域的实验研究方面取得了重要进展，促进了损伤后微环境的改善及神经因子的修复，神经功能的恢复[31]，但是在脊髓损伤后神经元的功能不可能完全恢复是既定事实。(1)神经干细胞治疗脊髓损伤存在两大难点：①在抑制瘢痕组织形成的同时诱导促进神经元生长；②预防神经干细胞出现继发性死亡[32]。当前人们在神经干细胞领域探索大多围绕细胞移植及替代治疗，在脊髓损伤领域除了神经干细胞的实验研究，通过脊髓刺激(SCS)弱施加的DC电场，也可促进神经突双向再生。尽管许多新型治疗方法在脊髓损伤实验的动物模型中显示出前景，但这些实验所模仿的脊髓损伤与患者的实际情况仍存在差距。(2)目前在脊髓损伤领域所探讨的神经干细胞大都是中枢神经系统，而有研究[33]报道指出中枢神经系统不具备与周围神经系统相同的再生能力，中枢神经系统功能会随着年龄的增长而降低。长期受伤的神经组织环境对神经干细胞的存活，生长和分化是一个巨大的挑战。在体外用细胞稳定填充的支架不一定用作体内不利环境的理想细胞载体。尽管在脊髓损伤修复领域的最新进展已经表明，中枢神经系统具有更多的固有再生能力但中枢神经系统是否具备与周围神经系统的再生能力仍待进一步研究证实。(3)体外生长并不能反映体内情况，J.Ruzicka[28]将IPS衍生是神经干细胞接种于LHM水凝胶上，在整个研究期间，LHM水凝胶支持材料中细胞可以粘附生长，然而细胞仍然不成熟。说明支架应用于脊髓损伤的修复领域仍需要更多的探索。虽然支架的整合和移植细胞的神经分化不能导致功能恢复，但它可以改变慢性脊髓损伤的微环境并可能使重要的生理功能恢复。(4)在开发细胞移植疗法治疗脊髓损伤时安全性是进一步的重要考虑因素，另外需要解决其取材及体外培养的难题。

总之，神经干细胞应用于脊髓损伤的神经修复是人类治疗脊髓损伤的希望，虽然神经干细胞的作用机制已经明确，但当其应用于脊髓损伤领域尚存在许多问题急需研究解决。