HPLC法测定妇血安片中特女贞苷的含量

胡珍珍 李淑琴 徐嘉华 源淑莹 曾志坚 向全生

1.江门市食品检验所，广东 江门529030；2.江门市药品检验所，广东 江门529030；3.广东德鑫制药有限公司，广东 江门529100

妇血安片主要由当归、益母草、女贞子、墨旱莲等12味中药材经加工制得，各药味相互作用，共同达到活血祛瘀、止血调经的作用，用于治疗血瘀经期延长，疗效显著［1］。其中女贞子为妇血安片中的处方君药，为处方中活血调经的主要药物。女贞子具有滋补肝肾、明目乌发的作用，用于眩晕耳鸣、肝肾阴虚、腰膝酸软、须发早白、目暗不明、内热消渴、骨蒸潮热等症［2-5］。女贞子主要成分有环烯醚萜苷类、三萜类、苯乙醇类、糖类和脂肪油类等，其中环烯醚萜苷类特女贞苷是女贞子的专属性成分之一，也是2015版中国药典用于女贞子含量测定的指标性成分［5，6］。将特女贞苷作为妇血安片质量标准提高的指标性成分，与妇血安片的功效息息相关，既可以控制其原药材的质量，还可以作为有效成分控制药品的质量，保证药品的疗效。妇血安片原有的质量控制标准只对女贞子、三七、丹参、仙鹤草、白术和党参进行了TLC鉴别，并对当归中阿魏酸的含量进行了测定［1］。处方中含量测定指标较少，尤其君药中的质量控制指标单一。为进一步完善产品质量标准，本研究以制剂中女贞子为研究对象，采用高效液相色谱法（HPLC）测定妇血安片中特女贞苷的含量。

1 设备与药品

1.1 设备 SHIMADZU LC-20AT高效液相色谱仪；METTLER TOLEDO电子天平。

1.2 试剂及样品 甲醇为色谱纯，水为超纯水；对照品特女贞苷（含量93.3%，批号111926-201605，购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用）。阴性对照样品由广东德鑫制药有限公司按标准制备并提供。妇血安薄膜衣片（规格0.52g/片，批号181101，181201，190101，190201，190202，190301，广东德鑫制药有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱柱及色谱条件 CAPCELL PAK C18（MG2）（5μm，250mm×4.6mm；柱温为35℃；流动相：甲醇-水（40∶60）；流速1.0mL/min，检测波长为224nm；进样量：10μL。

2.2 溶液准备

2.2.1 对照品溶液。准确称取特女贞苷对照品约25mg，置50mL容量瓶中加甲醇制成0.5mg/mL的对照品储备液。精密量取上述对照品储备液5mL置于20mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得0.125mg/mL的特女贞苷对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液。取妇血安片（批号：190201）20片，研细后准确称取约1.2g，置于锥形瓶中，精密加入50mL稀乙醇，称定重量，加热回流30分钟后冷却至室温，再称定重量，用稀乙醇补足损失的重量，摇匀、离心、滤过，取续滤液。

2.3 方法适用性考察 分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照样品溶液，按2.1中色谱条件测定，考察方法适用性（图1）。由图可见，供试品溶液在与特女贞苷对照品相同保留时间处出现色谱峰，而阴性对照品溶液在此保留时间处无峰，说明该方法适用性良好。

2.4 线性关系考察 精密量取“2.2.1”项下对照品储备液2、3、5、7、8、10mL置6个20mL容量瓶中，再加甲醇稀释至刻度，制成分别含特女贞苷0.05、0.075、0.125、0.175、0.200、0.250 mg/mL的系列溶液，按“2.1”中色谱条件测定峰面积。以溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。所得线性回归方程为：Y=11 352 836.87X+12 624.79；相关系数r大于0.999。结果表明在0.05～0.250 mg/mL范围内，特女贞苷浓度与峰面积具有良好线性关系。

图1 方法系统适用性色谱图

2.5 精密度考察 取“2.2.1”中对照品溶液按“2.1”中色谱条件连续进样6针，记录特女贞苷峰面积及保留时间。计算得，特女贞苷峰面积的RSD值为0.4%，保留时间的RSD值为0.1%（n=6），表明该方法的仪器精密度良好。

2.6 稳定性实验 取“2.2.1”中对照品溶液和“2.2.2”中供试品溶液10μL分别于0、2、4、8、12、24h注入色谱仪中，记录各时间的峰面积。结果对照品溶液和供试品溶液中特女贞苷峰面积的RSD值分别为0.5%和0.4%，表明对照品溶液与供试品溶液于24小时内均处于稳定状态。

2.7 重复性试验 取本品（批号为190201）粉末6份，各约1.2g，精密称定，并按“2.2.2”中方法制成供试品溶液。最后按“2.1”中的色谱条件测定，经计算得6次实验测定的特女贞苷平均含量为2.7mg/片，RSD值为1.8%（n=6），说明本方法的重现性良好。

2.8 准确度试验 取本品（批号为190201，含特女贞苷为5.13mg/g）20片，研细，取约0.6g，精密称定，按“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法设计高、中、低3种不同的浓度，使得对照品加入的浓度与供试品中待测成分含量之比控制在0.5∶1，1∶1，1.5∶1左右，最后按“2.1”中的色谱条件测定，计算样品回收率（表1），经计算得平均回收率为101.1%，RSD为1.1%（n=9），说明该方法的准确度较好。

表1 准确度试验

2.9 样品含量的测定 取6批妇血安片，按2.2.2项下的方法操作，测定含量。见表2。

表2 不同批次样品中特女贞苷含量测定结果

3 讨论

3.1 检测波长的选择 精密吸取对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，使用DAD检测器对特女贞苷进行全波长扫描，发现其在224nm处有最大吸收，同时参考中国药典及文献［3，5，8］，将检测波长定为224nm。

3.2 流动相组成及比例选择 通过查阅文献，筛选出以下流动相进行试验，流动相1［5］∶甲醇-水（40∶60）；流动相2［8］∶乙腈-水（18∶82）；流动相3［9］∶甲醇-0.05%磷酸水（34∶66）。结果：使用流动相1，2，3时样品分离度均大于1.5，特女贞苷峰的拖尾因子均小于2.0，且阴性样品图谱中与特女贞苷相应位置无干扰，但特女贞苷峰保留时间不同，分别为10～11分钟、19～20分钟、22～23分钟。结果显示，采用流动相1，主峰保留时间较短，节约时间与成本。因此，选择甲醇-水（40∶60）作为该试验流动相。

对不同比例甲醇∶水（30∶70，40∶60，50∶50，60∶40，70∶30）流动相进行考察，结果表明只有甲醇-水流动相在40∶60比例条件下样品分离度、拖尾因子均符合要求，且阴性样品在主峰相应的位置无干扰。故最终流动相确定为甲醇-水（40∶60）。

3.3 样品提取方法的选择 参考中国药典［5］及相关文献［3，4，8］，对用不同浓度的甲醇（50%、70%、100%）和乙醇（稀乙醇、70%、100%）作为提取溶剂，采用超声（功率500W，频率50kHz，提取15、30、60min）和加热回流（30、60、90min）两种提取方法进行考察。结果表明，用稀乙醇加热回流30min提取效果较好，而且稀乙醇较甲醇毒性低，方法简单快速，节能减耗。从而确定用稀乙醇加热回流提取30min为本试验的提取方法。

综上，本试验用HPLC法测定了妇血安片中君药女贞子的有效成分特女贞苷的含量，该方法专属性强、精密度高、稳定性好，可以有效提高妇血安片的质量控制。

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