薜荔榕小蜂幼虫虫龄的划分

包甜甜, 陈友铃, 吴文珊,*, 吴婷婷, 张兴坦, 周莲香

(1.福建师范大学生命科学学院, 福建省发育与神经生物学重点实验室, 福州 350117;2.福建农林大学海峡联合研究院基因组与生物技术中心, 福州 350002;3.台湾大学生态学与演化生物学研究所, 台北 10617)

昆虫幼虫虫龄划分是昆虫发育生物学的重要内容，对昆虫种群年龄结构和发生时间动态的研究至关重要。虫龄划分包括龄数和龄期的确定，最直接的方法是通过观察幼虫蜕皮次数确定龄数，两次蜕皮之间的时间为龄期，但是这种方法仅适于生长周期短(一般仅为1个月左右)，体型较大(蜕皮现象直观)，易采样或可室内饲养的昆虫；对于幼虫期发育期长、体型小、生活场所隐蔽，室内又无法培养的昆虫幼虫，其虫龄划分则是基于Dyar法则(相邻虫龄幼虫的虫体的某个部位呈几何级数增长)测量虫体某个外部形态指标(Dyar and Rhinebeck, 1890)，通过频次分布法分析幼虫发育增长规律进而确定虫龄，并依据Brooks(1886)、Floater(1996)和Crosby(1973)生长法则辅助推断。基于测量的精确性，测量指标首选幼虫骨化程度较高的部位，例如头壳、口钩和头咽骨(胡陇生等, 2012; 贺春玲等, 2015; Shietal., 2017)等，基于测量的便利性则选择体长、体宽和周长等作为测量指标(宗世祥等, 2006; 万喻等, 2015; 曹鹏等, 2018)。

薜荔Ficuspumilavar.pumila为桑科(Moraceae)榕属Ficus攀援藤本植物，广布于我国长江以南各省区，是热带和亚热带植物生态系统的关键树种，其瘦果水洗可作凉粉，根茎叶均可入药。薜荔耐贫瘠，抗干旱，不定根发达，攀缘及生存适应能力强，是城市垂直绿化的重要树种。薜荔依赖膜翅目(Hymenoptera)榕小蜂科(Agaonidae)的薜荔榕小蜂Wiebesiapumilae为其传粉，二者维持着长期稳定的互利共生关系(Chenetal., 2016)。虫龄划分是榕小蜂发生规律、生物学特性以及榕-蜂共生研究的基础，但由于榕小蜂的整个幼虫期都在榕果封闭的环境中度过，蜕皮难以观察，幼虫体长仅数十至数百微米，且无法室内培养，因此，目前关于榕小蜂的分龄方法和分龄标准的研究尚无人报道，均是依据幼虫形态特征的差异进行分龄: Jansen-González和Sarmiento(2008)将榕树Ficusandicola的传粉榕小蜂Pegoscapusbacataensis幼虫发育分为5龄；Jia等(2014)也将对叶榕F.hispida的传粉榕小蜂Ceratosolensolmsi幼虫发育分为5龄；但Yadav和Borges(2017)将聚果榕F.racemosa3种非传粉榕小蜂Sycophagatestacea、Apocryptasp.2和Apocryptawestwoodi幼虫发育划分为4龄。Jansen-González等(2012, 2014)虽利用频次分布法确定了榕树F.citrifolia的传粉蜂Pegoscapus sp.幼虫发育为4龄，以及非传粉蜂Idarnesflavicollis幼虫发育为3龄，但仅作为附录发表，没有虫龄划分过程的具体描述。综上所述，关于榕小蜂幼虫发育相关的研究结果少，依据形态特征进行划分的榕小蜂虫龄较为混乱，本研究旨在以头壳宽、第3节宽、体长和周长为测量指标，运用统计分析方法确定传粉榕小蜂幼虫的龄数和龄期，建立榕小蜂幼虫虫龄划分的方法和标准，为榕小蜂发育研究，以及榕-蜂协同进化研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

2018年7月8日在福建省福州市森林公园(26°15′N, 119°29′E)对薜荔幼果(直径1.5 cm)进行标记，并用尼龙网袋罩住以防止其他小蜂或昆虫进入薜荔果内干扰实验，待果实散发芳香气味，打开网袋放入小蜂，标记有小蜂进入的榕果，2 d后开始采样，采样时间从2018年7月10日至9月10日。每间隔3 d采集5个已被产卵的薜荔榕果，带回实验室，插水培养。

1.2 室内解剖及测量

对半切开薜荔榕果，置于SMZ745T解剖镜下将虫瘿取出，用昆虫针将虫瘿划开，取出小蜂，置于载玻片上，在Olympus SZ61体视显微镜下观察、并利用SteREO Lumar V12成像系统拍照，再用Image-Proplus 5.1显微测量系统对每头小蜂幼虫的头壳宽、第3节宽、体长和周长4项指标分别进行测量(图1)。共测量幼虫447头。

图1 薜荔榕小蜂幼虫测量示意图

1.3 数据分析

Crosby指数=(Bn-Bn-1)/Bn-1(其中Bn和Bn-1分别表示第n和n-1个Brooks指数)。

在确定龄数后，参考众数龄期测定法(戴志一, 1980; Caltagironeetal., 1983; 王小艺等, 2005)确定薜荔榕小蜂各龄的龄期。

2 结果

2.1 薜荔榕小蜂幼虫的龄数

对447头薜荔榕小蜂幼虫头壳宽、第3节宽、体长和周长4项指标的测量值进行频次分布的统计分析，结果表明，4项指标的频次分布均相对集中在5个区域：头壳宽的5个峰值分别在0.04, 0.07, 0.12, 0.19和0.27 mm左右(图2: A)；第3节宽的5个峰值分别在0.12, 0.25, 0.40, 0.67和0.85 mm左右(图2: B)；体长的5个峰值分别在0.24, 0.42, 0.79, 1.31和2.09 mm左右(图2: C)；周长的5个峰值分别在0.56, 1.01, 1.90, 3.03和4.49 mm(图2: D)。由此，根据Dyar法则可以断定，薜荔蜂幼虫的龄数为5龄。薜荔榕小蜂幼虫4项分龄指标的均值、标准误差、变化幅度和变异系数见表1。头壳宽、体长及周长这3项指标在薜荔榕小蜂不同虫龄之间的平均值具有显著差异(P<0.05)，且变异系数均小于20%，Crosby指数均小于10%，表明将薜荔榕小蜂幼虫分为5龄是合理的。头壳宽、体长和周长是比较理想的分龄指标；第3节宽由于其Crosby指数均大于10%且变异系数大于20%，因此不适合作为薜荔榕小蜂幼虫虫龄划分的指标。

表1 薜荔榕小蜂幼虫各分龄指标的测量结果

图2 薜荔榕小蜂各龄幼虫频次分布图

2.2 分龄指标测量值与虫龄之间的相关性

对薜荔榕小蜂幼虫的头壳宽、体长和周长3项分龄指标的各龄测量值与相应龄期之间进行回归分析(图3)，结果表明，3项指标与虫龄之间均符合Dyar法则所描述的指数关系，且各分龄指标测量值与虫龄之间均呈极显著正相关(P<0.01)，体长测量值与虫龄回归曲线的判定系数(R2)最高。因此，体长为分龄的最佳测量指标，同时也进一步表明薜荔榕小蜂幼虫龄数划分为5龄是准确的。

图3 薜荔榕小蜂幼虫分龄指标和虫龄之间的回归关系

2.3 薜荔榕小蜂幼虫各龄龄期

确定了薜荔榕小蜂幼虫的龄数后，进一步统计各龄幼虫不同日期出现数量及对应的累积百分比，将百分数转化为机值(概率单位，即表2回归方程中的y)，以机值作为纵坐标(为避免种群中两端极端数字影响，采用发育进度12.5%～87.5%之间的数值)，调查日期作横坐标(表2回归方程中的x设2018年8月4日等于1)，进行线性回归分析，计算出各龄的回归方程式y=a+bx。以机值5(发育进度=50%)为代表，两虫龄直线间的横坐标距离，即代表该虫龄的众数龄期(表2)。薜荔榕小蜂夏季1-5龄幼虫(图4)的龄期(L1-L5)分别为4.29, 13.19, 6.27, 24.46和8.90 d，总幼虫期为57.11 d(表2)。

表2 薜荔榕小蜂各龄幼虫的龄期计算

图4 薜荔榕小蜂各龄幼虫

3 讨论

3.1 榕小蜂幼虫最适分龄指标

由于绝大多数昆虫幼虫的头壳骨化程度高，各龄幼虫头壳宽不同，而同龄幼虫头壳宽大致固定，因此在昆虫幼虫虫龄划分的研究中，头壳宽是最常用的划分指标(贺春铃等, 2015; 万喻等, 2015; Luoetal., 2016; Goetal., 2019)，但薜荔榕小蜂幼虫微小，1-3龄幼虫的头壳宽多小于0.1 mm(且骨化程度不高)，只能通过幼虫活体拍照后对照片进行测量；拍摄角度不同易造成测量误差，同时，口器运动和头部内缩均影响头壳宽测量的准确性；头壳宽值比体长和周长小得多，因此相同的标准差，头壳宽的变异系数(标准差/平均值)较大，易导致分龄的偏差。本研究同时测量幼虫头壳宽、第3节宽、体长和周长4项指标，并经综合分析，筛选出体长是划分薜荔榕小蜂幼虫虫龄最佳的测量指标。

3.2 榕小蜂幼虫虫龄难以划分的原因

遵循Dyar法则，昆虫幼虫相邻两个龄期某一部位的长、宽度存在一定的几何级数关系，那么依据该部位测量值进行频次分布分析，其频次分布图中的一个频次分布集中区域即代表一个龄期(Hammacketal., 2003; Calvo and Molina, 2008; 杨美红等, 2012; Cazadoetal., 2014)。然而，薜荔榕小蜂以头壳宽、体长和周长的测量值建立的频次分布均无明显的分布聚集区(即无间隔聚集分布)，只能依据波峰与波谷的分布规律，将连续的分布区分出5个区间，代表5龄(图2)，并应用Brooks指数、Crosby指数验证分龄的合理性，其中1龄与2龄幼虫之间的区分尤为困难，其中原因有：(1)低龄期幼虫极其微小(μm级)，小到几乎进入显微镜的测量误差范围，从而造成了测量值的高标准差；(2)无法收集在完全相同条件下生长的幼虫。由于榕小蜂无法人工饲养，我们只能从同一天放蜂的不同的榕果中收集幼虫，果间幼虫种群发育差异可能是导致不同龄期幼虫分龄指标测量值交叠的主要原因；(3)1龄幼虫龄期最短，导致1龄和2龄幼虫分龄指标测量值交叠严重，极易造成龄数的误判，即将5龄误判为4龄。本研究结果表明以体长为测量指标，利用频次分布法能够确定榕小蜂幼虫的龄数，以众数龄期测定法能够确定榕小蜂幼虫的龄期。

3.3 薜荔榕小蜂龄期的变化

福建地区的薜荔榕小蜂通常一年产卵2次，春季通常在4月初产卵，产卵时间相对集中，该批次小蜂既为雌花传粉，也繁育后代，发育期约3～4个月；秋季小蜂产卵以繁育后代为主，产卵时间分散在7-10月间，于当年年末或翌年出飞，发育期短者4～5个月，长者达8个月(罗光坦等, 2000; Yangetal., 2017)，实验室长期观察数据表明：秋季小蜂发育的幼虫期和蛹期均比春夏季长，由此可见，幼虫的龄期极易随物候发生变化，在水热条件较好的春夏季幼虫龄期较短，而在寒冷干燥的秋冬季幼虫龄期较长，同理，幼虫龄期在不同地理位置、不同海拔高度也将发生变化，在后续研究中，我们将进一步关注榕小蜂幼虫龄期变化的规律性。