HPLC-MS/MS法同时测定保健食品中11种壮阳类非法添加

2020-03-03朱燕燕马桂娟龚慧

食品工业 2020年1期

朱燕燕，马桂娟，龚慧

宁夏回族自治区食品检测研究院（银川 750001）

近年来，补肾壮阳及缓解疲劳类保健食品中非法添加5型磷酸二酯酶抑制剂（Phosphodiesterase-5，PDE-5）现象时有发生。PDE-5中仅有西地那非、他达拉非、伐地那非批准上市，均为处方类药物，是临床上治疗男性勃起障碍的常用药[1]。临床上，PDE-5有严格的服用限量要求，消费者长期服用这些违禁保健食品，对人体健康造成严重威胁。

目前，PDE-5在保健食品中的检测手段主要有理化鉴别法、免疫法、近红外光谱法、薄层色谱法、显微共聚焦拉曼光谱法、高效液相色谱法[2-8]。理化鉴别法、免疫法、近红外光谱法、薄层色谱法、显微共聚焦拉曼光谱法及高效液相色谱法预处理比较简单，但其灵敏度低，选择性差，可能会造成假阳性。HPLCMS/MS法具有灵敏度高、准确度高等优点，成为保健食品等基质复杂样品的痕量物质确证的首选方法。国家食品药品监督管理局制定相关标准指导此类物质的检测[9]，但检测保健食品时应用该方法存在线性不好、回收率不高等情况，并且随着检测手段和仪器的不断发展，标准中的一些仪器参数及操作步骤需要进一步优化。试验旨在优化HPLC-MS/MS法同时检测11种壮阳类非法添加药物的方法并做出方法学的论证，为标准修订及有效监控保健食品中非法添加提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

保健食品（市售）。

11种那非类标准品（伐地那非、那红地那非、红地那非、羟基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他达拉非、他达拉非、硫代艾地那非、伪伐地那非、那莫西地那非对照品，德国Dr. Ehrenstorfer公司，纯度＞99%）；甲醇、乙腈（色谱纯，Thermo Fisher公司）；甲酸（色谱纯，德国Sigma公司）；超纯水（美国Milli-Q超纯水系统纯化）。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪（6410，美国Agilent公司，配有AJS ESI离子源及Mass Hunter数据处理系统）；超声机（B2200S-7，上海必能信超声有限公司）；氮吹仪（EVA50A，北京普利泰科有限公司）；分析天平（BT25S，北京赛多利斯科学仪器有限公司）；Milli-Q超纯水仪（美国Millinpore公司）。

1.3 分析条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；流速0.30 mL/min；柱温30 ℃；进样体积10 μ L；运行时间20 min；流动相A为0.1%甲酸水溶液；流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脱程序见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱程序

1.3.2 质谱条件

离子源，电喷雾离子源；扫描模式，正离子扫描；反应方式，MRM（多反应监测）模式；鞘气温度350 ℃，流速10.0 L/min；雾化器压力40 psi；毛细管电压4 kV，具体参数详见表2。

表2 11种壮阳类物质的质谱优化参数

1.4 试验步骤

1.4.1 对照品溶液的制备

分别精密称取11种那非对照品，各10 mg左右，置于10 mL容量瓶中，用乙腈制成约1.0 mg/mL的单标溶液。分别精密量取1.0 mL 11种标准溶液，置于100 mL容量瓶中，用乙腈稀释成10.0 μg/mL的混合标准储备液。同法将混合标准储备液分别稀释至0.010，0.025，0.050，0.100，0.200，0.500，1.000和2.000 μg/mL的标准工作溶液。

1.4.2 样品前处理

称取2.0 g（精确至0.02 g）样品于50 mL容量瓶中，加入30 mL乙腈后超声10 min，冷却至室温，用乙腈定容至刻度。用移液管准确移取2.0 mL定容液于试管中，40 ℃氮吹至干，用初始流动相（0.1%甲酸水溶液与0.1%甲酸乙腈溶液体积比80∶20）定容至2.0 mL，涡旋混匀，经0.22 μ m水相滤膜过滤，上机待测。

1.4.3 标准曲线的制作

分别准确移取0.010，0.025，0.050，0.100，0.200，0.500，1.000和2.000 μg/mL的标准工作溶液各100 μ L，准确移取空白基质提取液各900 μL稀释成浓度为1.0，2.5，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0和200.0 ng/mL的系列标准工作溶液。上机测定，记录数据，制作标准曲线。

1.4.4 加标回收率试验及精密度试验

按照1.4.2的方法制备3份样品溶液，分别向其中加入200 μ L 10.0 μ g/mL混合标准工作溶液、200和400 μ L 1.0 μ g/mL混合标准工作溶液，分别同时制备10组平行样，其余步骤同上，记录数据，计算回收率及RSD。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

由于11种那非的分子结构中均含有氨基，因此均采用正离子模式对其进行电离。分别对浓度为1.0 μg/mL的各目标化合物进行单针进样，对其质谱条件进行优化。当目标化合物进入一级质谱后，可以产生稳定的[M+H]+准分子离子峰。对准分子离子峰进行二级质谱分析，得到子离子的质量数，在MRM（多反应监测）模式下优化碰撞能等参数，使得子离子达到最佳响应。为11种那非类分别选取质谱响应最佳的2对MRM离子对及相应的参数作为最终质谱采集参数，详见表2。采集得到的MRM色谱图见图1。

图1 11种那非类标准品的MRM色谱图

2.2 基质效应

基质效应是在提取基质中的目标组分时，基质中的干扰物影响目标组分的离子化，使得目标组分在仪器上的响应发生增强或者抑制效应的现象[10]，影响分析结果的准确性。考察的11种那非类化合物在保健品中均有基质抑制效应。为提高目标化合物测量的准确度，该方法使用空白基质提取液配制标准曲线，降低基质干扰的影响。

2.3 方法的线性范围和检出限

将系列基质标准工作溶液分别进行测定，以质量浓度为横坐标，定量离子峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，11种那非在1.0～200.0 ng/mL的范围内，其浓度与各待测物的峰面积呈良好的线性关系。11种添加物的线性回归方程、线性范围、相关系数、检出限（信噪比S/N≥3）见表3。

表3 11种那非类物质的线性回归方程，相关系数，线性范围和检出限

2.4 方法的准确度和精密度

由不含目标组分的保健品作为空白样品进行3个水平的加标回收率试验，加标浓度水平分别为0.1，0.2和1.0 mg/kg，其中伐地那非的回收率范围为72.6%～108.6%，红地那非的回收率范围为86.5%～120.7%，那红地那非的回收率范围为83.7%～116.5%，豪莫西地那非的回收率范围为77.6%～116.4%，枸橼酸羟基豪莫西地那非的回收率范围为85.4%～116.4%，西地那非的回收率范围为82.3%～114.7%，氨基他达拉非的回收率范围为86.5%～111.5%，硫代艾地那非的回收率范围为62.5%～79.4%，他达拉非的回收率范围为83.2%～120.1%，伪伐地那非的回收率范围为82.1%～106.3%，那莫西地那非的回收率范围为85.5%～108.2%。其相对标准偏差范围为4.2%～9.5%，其精密度符合方法学要求。11种那非类的回收率及相对标准偏差的数据见表4。

表4 11种那非类回收率及精密度试验

2.5 色谱条件的优化

11种那非在不同的流动相中分离程度不同，对比三种流动相甲醇-乙酸铵溶液，乙腈-乙酸铵溶液，甲酸乙腈-甲酸水溶液。通过试验，各待测物在甲酸乙腈-甲酸水溶液流动相中的分离度及峰型良好。因此，选择0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相；在Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱，通过梯度洗脱对11种添加物进行分离，目标化合物的保留时间在5～15 min之间。