GO/HF-SPME-HPLC-MS/MS测定牛奶中7种糖皮质激素

2020-03-03余鹏飞倪娟桢赵月钧陈可董叶箐何晓明

食品工业 2020年1期

余鹏飞，倪娟桢，赵月钧，陈可，董叶箐，何晓明

绿城农科检测技术有限公司（杭州 310052）

糖皮质激素，是一种肾上腺分泌的类固醇激素，具有抗炎、抗过敏、抗休克和抗免疫抑制等作用，还可用作动物的生长促进剂，加快动物生长，在畜牧业生产中广泛应用[1-2]。然而有研究表明，过量使用会导致动物源性食品中药物残留，对人类健康产生危害[3]。农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》[4]对牛奶中部分糖皮质激素类药物的检出和最高限量值做出明确规定：地塞米松0.3 μg/kg，氢化可的松不得检出。

糖皮质激素的检测方法主要包括气相色谱-质谱法（GC）[5]、液相色谱法（LC）[6-7]和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[8-11]，其中，液相色谱-串联质谱法以其特异性强、灵敏度高和重现性好的特点，为兽药检测首选方法。由于糖皮质激素在牛奶中通常以痕量存在，在进行检测分析前需进行浓缩、富集和净化等步骤，现有的国家标准与文献报道多采用固相萃取[8,12]、液液萃取[9]、基质固相分散萃取[10-11]等对样品进行前处理，这些方法的有机溶剂用量大、操作步骤繁琐复杂、耗时较长，不能满大批量快速检测样品的要求。因此，建立一种简单、快速、灵敏的前处理方法用于筛查牛奶中糖皮质激素残留尤为重要。

中空纤维微萃取（HF-SPME）是一种利用中空纤维的微孔孔径较小限制样品溶液中的大分子物质进入萃取相，集萃取和净化一步完成的样品预处理技术。在环境、生物样品痕量分析中有良好使用[13-15]。但是，中空纤维中作为受体相的有机溶剂存在容易在萃取过程中溶于样品溶液的情况，降低萃取效率。

氧化石墨烯是近年来兴起的一种新型纳米材料，具有超大的比表面积及丰富的含氧官能团，可与有机化合物形成π-π相互作用，被广泛应用于样品的前处理研究[16-17]。近年来，有研究者将中空纤维和氧化石墨烯2种材料独特的优点相结合，制备氧化石墨烯/中空纤维复合材料用于样品前处理过程并取得良好的应用效果[18-19]。

该方法采用中空纤维/氧化石墨烯用于样品前处理，并与高效液相色谱-串联质谱法相结合建立同时测定牛奶中7种糖皮质激素的分析方法。该方法简单高效，同时灵敏度也能满足日常检测需求，适合于实验室大批量检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糖皮质激素标准品：倍氯米松、地塞米松、甲基泼尼松龙、氟氢可的松、氢化可的松、可的松、泼尼松龙（德国Dr. Ehrenstorfer公司，纯度≥95%）；氘代氢化可的松内标物（加拿大CDN公司，纯度≥99%）。

1.2 仪器与设备

三重四级杆液相色谱/串联质谱仪（LC-MS 8050，日本Shimadzu公司）；多管涡旋混合仪（DMT-2500，杭州米欧仪器有限公司）；超声波清洗器（KQ-500E，昆山市超声仪器有限公司）；超纯水机（美国Millipore公司）。

1.3 方法

1.3.1 氧化石墨烯/中空纤维制备

将中空纤维膜剪成长度约2 cm小段，用丙酮超声清洗10 min，取出晾干。取50 mg氧化石墨烯分散于100 mL N, N-二甲基甲酰胺中，超声分散2 h，制备成500 mg/L氧化石墨烯溶液。将晾干的中空纤维浸入500 mg/L氧化石墨烯溶液中超声2 h，使氧化石墨烯完全固定在中空纤维膜的微孔中，取出用去离子水洗涤数次，除去中空纤维表面及内部多余的氧化石墨烯，晾干备用。

1.3.2 标准溶液的配制

准确称取适量的标准品，用甲醇分别配制成100 mg/L的标准贮备液，置于-18 ℃冰箱保存。使用时，用甲醇稀释成各种浓度的混合标准工作液和内标工作液，备用。

1.3.3 样品前处理

在多少个寒冷的、屋顶漏水的晚上，易非彻夜不眠，她睁着眼睛盯着屋顶，脑海里一遍又一遍地重复这句话：我是爸爸的亲女儿呢，能不像爸爸吗？易非觉得爸爸一直在黑暗中陪着她，甚至不时用他那有着淡淡烟草味道的双手抚摸着她的头。只有爸爸仍然把她当一个孩子来看待。

称取5 g样品于10 mL离心管中，加入50 μL 500 μg/L氘代氢化可的松同位素工作液，用0.1 mol/L的NaOH溶液调至pH 10，将处理好的氧化石墨烯/中空纤维放入离心管中，超声萃取10 min。取出氧化石墨烯/中空纤维，滤纸擦干后放入装有1 mL甲醇的小瓶中，超声解析3 min，经0.22 μ m滤膜过滤后待测。

1.3.4 仪器条件

1.3.4.1 色谱条件

ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；进样量3 μ L；柱温40 ℃；流动相A为0.1%甲酸-2 mmol/L水溶液，B为乙腈溶液；流速0.15 mL/min；采用梯度洗脱的分离程序，洗脱程序：0～0.5 min，10% B；0.5～1.5 min，10%～40% B；1.5～2.5 min，40%～90% B；2.5～5 min，90% B；4～5 min，65%～90%B；5～6 min，90%～10% B。

1.3.4.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI）：负离子模式；加热块温度400 ℃，毛细管电压4 000 V；雾化气流量3.0 L/min；加热气流量10.0 L/min；定性与定量离子对、碰撞能量等参数见表1。

表1 7种糖皮质激素及相应内标物质谱参数

2 结果与分析

2.1 萃取条件的优化

2.1.1 样品量的优化

由于糖皮质激素类药物在牛奶中以痕量存在，加大样品的称样量，增加富集倍数，是提高实际检测浓度的有效手段之一。考察样品1～10 g时对萃取效率的影响。结果表明（见图1），样品量增加到5 g时，萃取效率没有明显变化，继续增加样品量，萃取效率逐渐减少。这可能是样品量5 g时刚好达到吸附平衡，样品量继续增大，仅用2 cm的氧化石墨烯/中空纤维和10 min的萃取时间无法充分吸附目标化合物，致使萃取效率降低。因此，选择样品量为5 g。

图1 样品量对萃取效率的影响

2.1.2 样品溶液pH的优化

样品溶液pH不仅能改变目标化合物的存在形态，也会改变吸附材料表面电荷和密度，是影响萃取效率的重要因素。考察pH 4～14的萃取效率。结果表明（见图2），pH 4～10时，随着pH增加，萃取效率明显增大。这是由于目标化合物为碱性化合物，在碱性环境中呈分子状态，随着pH增大，与氧化石墨烯之间的疏水作用力增强，萃取效率增大；之后随着pH增大，萃取效率略有下降，这可能是氧化石墨烯絮凝沉淀的关系。因此，试验选择最佳pH 10。

图2 样品溶液pH对萃取效率的影响

2.1.3 萃取条件的优化

试验比较超声萃取和振荡萃取2种萃取方式对7种糖皮质激素类萃取效率的影响。结果表明（见图3），在相同时间下，超声萃取的萃取效率明显好于涡旋萃取。这是因为涡旋萃取时容易产生气泡附在中空纤维膜的外壁，影响目标化合物的萃取，而超声萃取时超声波辐射产生的强烈空化效应、机械效应和热效应可以加强传质过程，从而提高萃取效率。

图3 萃取方式萃取效率的影响

进一步考察萃取时间（4～14 min）对萃取效率的影响。结果表明（见图4），萃取时间10 min时萃取效率最好，萃取时间继续增加，解析效率略有下降，可能是过长的超声时间使氧化石墨烯从中空纤维壁上脱落。因此，试验选择萃取方式为超声萃取10 min。

图4 萃取时间对萃取效率的影响

2.1.4 离子强度的优化

在水溶液中加入适量的盐可以增加离子强度，减少目标化合物在样品中的溶解度，有助于提高萃取效率。通过在样品溶液中加入不同浓度NaCl（0～20%），考察离子强度对目标化合物萃取效率的影响。结果显示，在其他条件不变时，额外添加NaCl对目标化合物的萃取效率无显著影响。因此，试验选择不加NaCl。

2.1.5 解析条件的优化

萃取完成后，为了将目标化合物从氧化石墨烯/中空纤维上尽可能完全地解析，试验考察甲醇、乙腈、丙酮、异丙醇4种解析溶剂的解析效率。结果表明（见图5），甲醇的解析效率最好。

进一步考察解析溶剂用量为0.5～3 mL时对于解析效率的影响。结果表明，随解析溶剂用量增加，解析效率逐渐变大，解析溶剂用量1 mL时，解析效率达到最大；继续增加解析溶剂用量，解析效率基本不变。

考察解析时间在1～5 min范围内对萃取效果的影响。结果表明，解析时间在1～3 min时，随着时间增加，解析效率逐渐提高；超过3 min后解析效率趋于平稳，说明3 min时基本能达到解析完全。因此，试验采用1 mL甲醇作为解析溶剂，解析时间3 min作为最佳解析条件。

图5 解析溶剂对萃取效率的影响

2.2 基质效应

基质效应在质谱分析中普遍存在，共流出干扰物对目标物离子造成的离子抑制或增强效应，可能严重影响定量的准确性。试验采用提取后添加法，测定空白基质提取液与纯溶剂中同浓度目标化合物的离子响应强度，通过二者比值来评价基质效应（ME）。如式（1）所示。结果表明（见表2），除氟氢可的松外，其余6种目标化合物基质效应影响不大，说明中空纤维的微孔结构有效限制牛奶中的蛋白质、脂肪等大分子物质进入，具有减弱基质干扰的能力。试验参照GB/T 21981—2008[12]采用氘代氢化可的松同位素内标校正，因此无须使用基质匹配的标准曲线进行测定，从而提高该方法在日常检测效率。

式中：A和B分别为纯溶剂与基质溶液中目标化合物的峰面积。若ME＜0.8，说明基质对目标化合物产生较强的抑制作用；ME＞1.2，则说明基质增强效应；0.8＜ME＜1.2表明基质效应可以忽略。

2.3 方法学验证

2.3.1 线性范围、检出限及定量限

配制6点不同质量浓度的混合标准溶液，溶液中7种糖皮质激素质量浓度分别为1，5，10，25，50和100 μg/L，氢化可的松同位素的质量浓度均为25 μg/L，以浓度（X，μg/L）为横坐标，目标化合物峰面积与内标物峰面积的比值（Y）为纵坐标绘制标准曲线。从表2可以看出，7种目标化合物线性相关性良好，相关系数不低于0.99。根据检出限大于等于3倍信噪比，定量限大于等于10倍信噪比的计算方法，得出7种糖皮质激素的方法检出限为0.04～0.09 μ g/kg，定量限为0.12～0.30 μ g/kg。