保健食品中13种那非类物质快速检测及确证

范小龙，吴婉琴，曾妮，黎星，黄坤，王会霞

湖北省食品质量安全监督检验研究院，湖北省食品质量安全检测工程技术研究中心（武汉 430000）

随着对养生保健日趋重视，保健食品种类越来越多，然而市场竞争加剧，保健品的促销方向出现向保健品中非法添加化合物的情况[1]，以暂时的速效、高效或特效，谋取高额非法利润，致使患者出现严重不良反应，甚至导致死亡，其中补肾壮阳类保健品是那非类药物违规添加的重点[2-4]。那非类药物是一种壮阳的精神类药物，西地那非等均属于磷酸二酯酶5（PDE5）抑制剂的处方药，1998年经美国食品药品监督管理局批准，是治疗男子阴茎勃起功能障碍（ED）有效药物，但长期或超剂量服用易对心血管系统、神经系统、消化系统等造成严重损伤[5]，国家严禁在保健食品中违规添加。

那非类物质检测标准主要是液相串联质谱方法，液相色谱方法较少[6]。《药品检验补充检验方法和检验项目批准编2009030》中讲述的是液相方法，但其方法过于陈旧，且部分那非物质并没有良好的分离度，那非类药物检测最新的方法为《市场监管总局关于发布〈食品中那非类物质的测定〉食品补充检验方法的公告》[7]，其中方法一规定的为液相串联质谱法，方法二为液相串联质谱-高分辨质谱方法，均为质谱方法，质谱方法检出限低、检测更灵敏。试验前期对收集的阳性样品检测，发现那非类物质的添加量很高，因此用质谱测定时需要稀释数万倍甚至百万倍，若稀释倍数不当直接进行质谱测试，则会污染质谱，试验表明西地那非容易残留于质谱中；同时，反复稀释容易造成定量误差。因此，建立同时测定13种那非类物质的液相色谱定量及液相串联质谱定性的分析方法将有助于解决这一问题。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters e2695高效液相色谱；Waters PDA 2998紫外检测器；Waters TQ-S型超高液相色谱-串联质谱仪；Talboys涡旋仪；Elma超声仪。

超纯水；乙腈、甲醇、乙酸、乙酸铵（色谱级，Fisher公司）；标准物质（详细信息见表1）：那红地那非、红地那非、伐地那非、羟基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他达那非、他达那非、硫代艾地那非、伪伐地那非、那莫西达那非（含量≥98%，中国食品药品检定研究院）；去甲基他达那非、硫代西地那非（含量≥99.5%，TRC公司）。

表1 那红地那非等13种物质相关信息

1.2 样品

10种声称具有抗疲劳、提高免疫力保健食品，10种保健酒。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的制备

1.3.1.1 固体样品

片剂：样品研细、混匀；胶囊：直接混匀，称取约0.5 g一次口服剂量，置于50 mL容量瓶中，加入乙腈，超声20 min溶解，放至室温，用乙腈定容至刻度，混匀后过0.22 μ m滤膜，待上机。

1.3.1.2 液体样品

直接称取约10 g一次口服剂量，置于100 mL容量瓶中，加入乙腈，超声20 min溶解，放至室温，用乙腈定容至刻度，混匀后过0.22 μm滤膜，待上机。

1.3.2 标准溶液制备

1.3.2.1 标准储备液

分别精密称取适量13种标准品置于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，制成质量浓度约2 mg/mL标准储备液，于-20 ℃保存，有效期3个月。

1.3.2.2 混合标准中间工作液

分别精密吸取适量标准储备液，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度41.65 μg/mL西地那非、18.8 μg/mL红地那非、43.05 μg/mL那莫西达那非、38.32 μg/mL去甲基他达那非、39.375 μg/mL硫代西地那非、其他8种质量浓度40.75 μ g/mL的混合标准中间液。

1.3.2.3 混合标准工作液

取适量混合标准中间液，用乙腈稀释至样品检测的浓度。

1.3.3 色谱条件

色谱柱，Waters Symmetry Shield C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A，乙腈；流动相B，20 mmol/L乙酸铵水溶液（含0.1%乙酸），梯度见表2，柱温35℃，进样量10 μL。

表2 流动相梯度程序

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择

比较Waters Symmetry Shield C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱对13种那非类的分离效果，在同一流动相条件下，其中羟基豪莫西地那非和氨基他达那非最大吸收波长均在290 nm左右，在XBridge色谱柱上色谱峰叠加在一起，始终无法分离，而在Symmetry Shield C18色谱柱上均能实现良好分离，而且灵敏度更高，峰形更尖锐，高液相色谱图及各物质最大吸收波长见图1。因此试验选用Waters Symmetry Shield C18色谱柱作为分离色谱柱。

2.1.2 流动相的选择

试验比较乙腈-纯水、乙腈-20 mmol/L乙酸铵溶液（0.1%乙酸）和乙腈-20 mmol/L乙酸铵溶液（0.1%甲酸）3种流动相体系分离效果。采用乙腈-水时，13种那非类化合物，峰形拖尾，导致分离度不理想；采用乙腈乙腈-20 mmol/L乙酸铵溶液（0.1%甲酸）时，其中硫代艾地那非和伪伐地那非无法分离；采用乙腈-20 mmol/L乙酸铵溶液（0.1%乙酸）时，13种那非类均有良好的分离度和峰形。因此试验选择乙腈-20 mmol/L乙酸铵溶液（0.1%乙酸）作为流动相。

2.2 标准曲线、线性范围、方法检出限及方法定量限

配制系列的混合标准溶液，以各分析物的峰面积（Y）和相应的质量浓度（X，μg/mL）绘制标准曲线，得到线性回归方程。结果表明，各目标化合物在线性范围内13种那非类的线性关系良好；配制标准溶液混标，用空白基质溶液稀释到适量浓度，以仪器3倍和10倍信噪比确定方法检出限和方法定量限，结果见表3。

2.3 回收率和精密度

以空白基质样品进行低（1倍定量限）、中（5倍定量限）、高（10倍定量限）3个水平加标回收试验，每个水平测定6次，结果见表4。结果表明，13种那非类的平均回收率为92.64%～109.17%，相对标准偏差（RSD）为0.75%～5%。说明该方法具有良好的准确度和精密度。

2.4 实际样品分析

应用该方法对市售的保健食品（标称具有抗疲劳功效）共计20份进行测定，其中6份均检测出西地那非，含量为10～20 mg/g；1份样品检测出他达那非，含量为3.71 mg/g；1份样品检测出伐地那非，含量为2.83 mg/g；剩余12份未检出那非类，见图2。在测定时有2份样品在液相色谱图上出现保留时间和紫外光谱图和西地那非标准色谱图一样的峰，由于含量在检出限附近，最后通过超高液相串联质谱的确证，确定该样品中含有西地那非。

图1 13种化合物液相色谱图及其紫外吸收光谱图

表3 13种那非类物质的标准曲线、线性范围、方法检出限、方法定量限

表4 13种那非类物质的回收率及精密度

图2 阴性样品液相色谱图及不同阳性样品色谱图

3 结论

在测定保健食品样品时，13种那非类中西地那非检出率最高，约30%，主要原因可能是西地那非是当前市场上流行的治疗勃起功能障碍的口服速效处方药，且价格低廉，质量有保证，故被不良厂商非法添加到保健食品，以达到速效、高效的保健、滋补、壮阳、强身等目的，从而拓展销路且非法牟利[8]。为打击不良厂商在保健食品中非法添加那非类物质，试验建立高效液相色谱同时分离测定13种那非类物质及采用液相色谱串联质谱对不确定的阳性样品进行快速确证的分析方法，该方法操作简单、灵敏度高，可满足保健食品中那非类物质非法添加的检测要求，为保健食品中那非类药物非法添加监管理提供检测技术。