SPE-HPLC法测定食品中8种合成着色剂

胡贝，李丽霞，刘红，黄伟，李晓健

湖北省药品监督检验研究院（武汉 430075）

合成着色剂是在食品生产加工过程中，为改善食品色泽、增进人的食欲而添加的一类食品添加剂[1]，多以苯、甲苯、萘等化工产品为原料，经过磺化、硝化、偶氮化等一系列有机反应化合而成[2-3]，由于其色泽鲜艳、性质稳定、成本低廉等诸多优点，迅速得到了广泛的推广与应用[3-4]。但合成着色剂不仅没有任何营养价值，而且绝大多数对人体有害，毒害作用不仅表现为一般毒性和致泻性，有些品种还具有致癌性[3]。因而，建立快速、准确的同时检测多种合成着色剂的方法，对于高效监管、保障食品安全有着重要意义。

目前，GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中明确规定了各种合成着色剂的使用范围和使用限量。GB 5009.35—2016及SN/T 1743—2006中分别规定了食品中7种及4种合成着色剂的检测方法，其中净化步骤所使用的聚酰胺粉吸附法操作繁琐、试剂消耗量大、耗时长，已不能满足大批量食品样品中多种合成着色剂的同时检测工作。文献报道合成着色剂的检测方法主要有固相萃取-高效液相色谱法[2,5-18]、液相色谱-质谱联用法[19-21]，其中固相萃取-高效液相色谱法的使用更为广泛。固相萃取法作为食品检测中常用的一种前处理方法，对样品的净化、富集有着重要的作用。而此前对于检测食品中多种合成着色剂所适用的固相萃取小柱的筛选报道较少。因此，试验选择了4种适用于同时检测食品中8种合成着色剂（柠檬黄、日落黄、胭脂红、苋菜红、亮蓝、诱惑红、新红、酸性红）的固相萃取小柱进行比较，并优化色谱条件，建立了一种高效、准确的测定食品中8种合成着色剂含量的固相萃取-高效液相色谱方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

1260型高效液相色谱仪（安捷伦科技（中国）有限公司）；N-EVAP型氮吹仪（美国Organomation公司）；ST 16型台式离心机（德国Thermo公司）；XP 205型电子天平（瑞士梅特勒公司）；VM 24型固相萃取仪（天津博纳艾杰尔科技有限公司）；Milli-Q纯水机（德国默克公司）。

1.2 标准物质与试剂

柠檬黄、日落黄、胭脂红、苋菜红、亮蓝（中国计量科学研究院）；诱惑红（北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司）；新红（农业部环境保护科研监测所）；酸性红（德国Dr. Ehrenstorfer GmbH）。

甲醇（色谱级，德国默克公司）；乙酸铵（优级纯，天津市大茂化学试剂厂）；甲酸、氨水（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；试验用水（GB/T 6682规定的一级水）；Cleanert JXA固相萃取小柱（1 g/6 mL，天津博纳艾杰尔科技有限公司）；Cleanert PWAX固相萃取小柱（150 mg/6 mL，天津博纳艾杰尔科技有限公司）；WAX固相萃取小柱（150 mg/6 mL，OASIS，Waters公司）；ProElut PWA-2固相萃取小柱（150 mg/6 mL，迪马科技）；亲水PTFE针孔式过滤器（月旭科技（上海）股份有限公司）。

1.3 色谱条件

色谱柱：Thermo AcclaimTM120 C18色谱柱（5 μ m，4.6 mm×250 mm），流速1 mL/min，柱温30 ℃。检测波长：柠檬黄、日落黄、胭脂红、苋菜红、诱惑红、新红均为254 nm；亮蓝为628 nm；酸性红为520 nm；进样量10 μL，流动相梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.4 溶液配制

1.0 mg/mL酸性红标准储备溶液：称取适量酸性红标准品于10 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀即得。

混合标准工作溶液：分别量取适量标准储备溶液，加水定容至刻度，依次配制成质量浓度为1.0，5.0，10.0，20.0和50.0 μg/mL的混合标准工作溶液。

1.5 样品处理

1.5.1 提取

液体类或可直接溶于水的样品，如饮料（含二氧化碳样品加热或超声10 min驱除二氧化碳）、配制酒（加热10 min驱除乙醇）、硬糖等，将样品均质化处理后，准确称取约2.0 g样品于50 mL塑料离心管中，加入20 mL提取液（水-甲醇-甲酸体积比10∶5∶3）（必要时可40 ℃水浴加热溶解），混匀后，超声提取15 min，所得样液待净化。

其他半固体或固体样品，如炒货食品及坚果制品、豆制品、米面及其制品、肉制品、酱腌菜、冰淇淋、雪糕、蜜饯、水果干制品、果酱、水果罐头等，将样品均质化处理后，准确称取约2.0 g样品于50 mL塑料离心管中，加入20 mL提取液（水-甲醇-甲酸体积比10∶5∶3），混匀后，超声提取15 min，以5 000 r/min离心10 min，取上清液过滤，所得样液待净化。

1.5.2 净化

将全部样液转移至经5 mL甲醇、5 mL 10%甲酸水溶液活化的ProElut PWA-2固相萃取小柱中，以1.0 mL/min的流速使样液全部通过固相萃取柱，弃去流出液。用5 mL甲醇淋洗，用5 mL 15%氨化甲醇溶液洗脱并收集，收集液于50 ℃氮气吹至近干，然后用2 mL 0.02 mol/L乙酸铵溶液复溶，过0.45 μ m PTFE滤膜，上机测定。

2 结果与讨论

2.1 固相萃取小柱的选择

试验选择了4种固相萃取小柱进行试验。其中，Cleanert JXA柱为聚酰胺粉成品柱，填料与GB 5009.35—2016中聚酰胺粉使用量相同。Cleanert PWAX柱、WAX柱均为混合型弱阴离子交换柱，具有弱阴离子交换与反相混合机理，均以水可浸润型聚合物为基质，在pH 0～14范围内稳定，对强酸性化合物具有高的选择性和灵敏度；ProElut PWA-2柱的固定相为含亲水基团的聚苯乙烯、二乙烯基苯的共聚物，作用基团为哌嗪基团、苯基、乙烯基和吡咯烷酮基，保留机理主要为阴离子交换相互作用和非极性相互作用，其次是极性相互作用，主要用于分离纯化强酸性化合物。

对4种固相萃取小柱分别进行低、中、高浓度（加标量为0.5，5.0和10.0 mg/kg）的加标回收试验（每组6个平行样），结果显示：使用Cleanert JXA柱进行净化时，样液流经小柱的速度缓慢，且目标化合物不易洗脱，净化时间明显长于其他3种小柱，虽然8种合成着色剂在Cleanert JXA柱上的平均回收率为84.3%～99.7%，相对标准偏差为0.3%～4.8%，但耗时长，试剂消耗量多，不能达到高效净化的目的。使用WAX柱进行净化，当加标量为0.5 mg/kg时，胭脂红的平均回收率仅为25.0%，相对标准偏差为2.8%；酸性红的平均回收率为38.7%，相对标准偏差为3.6%；其余6种合成着色剂的平均回收率为82.7%～100.1%，相对标准偏差为1.6%～4.8%。结果表明，WAX柱对低浓度的合成着色剂，特别是胭脂红和酸性红的回收率低，难以进行准确定量。使用Cleanert PWAX柱和ProElut PWA-2柱进行净化时，净化过程均较快，但ProElut PWA-2柱对8种合成着色剂的回收率均高于Cleanert PWAX柱，重现性更好。因此，试验采用ProElut PWA-2柱。

2.2 色谱柱的选择

在相同色谱条件下，比较Thermo AcclaimTM120 C18（5 μ m，4.6 mm×250 mm）、COSMOSIL C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）、DIKMA PLUS-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）三种C18柱，目标组分均有较好的分离度及稳定的保留时间，检测结果无显著性差异。试验选择了Thermo AcclaimTM120 C18（5 μ m，4.6 mm×250 mm）进行试验。

2.3 波长的选择

GB 5009.35—2016和SN/T 1743—2006中仅用单波长测定不同种类着色剂，大大降低了亮蓝和酸性红的检测灵敏度和特异性。因此，利用DAD检测器多通道检测功能对各种着色剂在190～640 nm范围内分别进行扫描，得到的亮蓝和酸性红的最大吸收波长分别为628和520 nm。因此，确定亮蓝的检测波长为628 nm；酸性红的检测波长为520 nm，柠檬黄、日落黄、胭脂红、苋菜红、诱惑红、新红的检测波长均为254 nm。8种合成着色剂的混标色谱图见图1。

图1 8种合成着色剂混标色谱图

2.4 线性范围、检出限及定量限

混合标准工作溶液的质量浓度分别为1.0，5.0，10.0，20.0和50.0 μ g/mL，按1.3色谱条件进样分析，以各个组分的峰面积和浓度绘制标准曲线，以3倍信噪比计算检出限，10倍信噪比计算定量限。结果见表2。

表2 8种合成着色剂的线性方程、相关系数、检出限及定量限

2.5 加标回收率和精密度试验

称取18份均匀的空白果汁样品（每份约2.0 g），分为3组（每组6个平行样），分别添加适量8种合成着色剂的混合标准溶液，使样品中8种合成着色剂的加标量分别为0.5（低），5.0（中）和10.0 mg/kg（高）三个水平，按1.5处理样品进行回收试验，计算回收率和测定值的相对标准偏差（RSD），结果见表3。空白样品和5.0 mg/kg加标样品溶液的色谱图见图2。结果表明，8种合成着色剂的平均回收率为86.5%～99.5%，RSD为0.5%～2.7%。该方法回收率和重现性良好，结果准确可靠，可以采用外标法进行准确定量。

图2 空白样品及加标样品的色谱图

表3 精密度与回收率试验结果（n=6）

2.6 样品测定

对市售的20份水果干制品按照试验所建立的方法进行检测。检出1份柠檬黄，含量为0.010 g/kg，2份日落黄，含量分别为0.001和0.020 g/kg，检出率为15%，其余6种合成着色剂均未检出。

3 结论

试验建立了一种固相萃取-高效液相色谱法测定食品中8种合成着色剂的方法，对4种固相萃取小柱进行比较，对色谱条件进行优化，考察了方法的线性范围、方法检出限、加标回收率及精密度等，有效地解决了食品中8种合成着色剂的高效净化富集、液相色谱条件的优化、准确定性定量的三大关键问题，该方法操作简便，灵敏度高，回收率和重现性良好，适用于大批量食品中8种合成着色剂的日常监测。