RP-HPLC法测定面包中丙酸

2020-03-03邹沫君

食品工业 2020年1期

邹沫君

乐山市食品药品检验检测中心（乐山 614000）

丙酸又称初油酸，是无色、有腐蚀性易燃的液体，毒性比甲酸小，对眼睛、皮肤、黏膜有刺激作用，与乙酸一样有杀菌性，能抑制细菌的生长，主要用作食品防腐剂和防霉剂[1]。至今广泛用于食品防腐剂的三大品种为苯甲酸及其钠盐，山梨酸及其钾盐，丙酸及其盐钠盐、钙盐。苯甲酸及其钠盐是使用时间最长且应用最广泛的食品防腐剂，现今随着人们对其毒性有了一定的认识，不少国家已明令限值或减少使用，而逐渐以山梨酸及其钾盐、丙酸及其钠盐、钙盐代替[2]。丙酸的防真菌和霉菌效果在pH 6.0以下时优于苯甲酸，价格低于山梨酸，是理想的食品防腐剂之一，因而作为食品防腐剂在我国具有巨大的潜在市场[3]。

1 仪器与材料

1.1 仪器与设备

DGU-20A 5R高效液相色谱仪（日本岛津公司）；FA124电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；TG-16医用离心机（四川蜀科仪器有限公司）；PHSJ-4A pH计（上海盛磁仪器有限公司）；JJ-2组织捣碎匀浆仪（江苏金坛市环宇科学仪器厂）；KQ-700型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DB206电热鼓风恒温干燥箱（成都电烘厂）。

1.2 材料与试剂

20批试样（市售，预包装食品，每批试样均来自不同的生产厂家）；丙酸标准品（Lot：123854，99.9%，Dr. Ehrenstrofer GmbH）；磷酸、磷酸氢二铵（分析纯，北京百灵威科技有限公司）；水为超纯水（电阻率=18.2 MΩ·cm）。

2 方法与结果

2.1 色谱分离系统的确定

2.1.1 标样的制备

精确称取25.0 mg丙酸标准品于25 mL容量瓶中，加水至刻度，于4 ℃冰箱中保存，有效期为3个月。

2.1.2 样品前处理

准确称取5 g（精确到0.01 g）经组织捣碎机捣碎、35 ℃风干2 h的面包试样至100 mL烧杯中，加20 mL水，加入0.5 mL 1 mol/L磷酸溶液，混匀，超声波浸提10 min后，用1 mol/L磷酸溶液调pH至3，转移试样至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，将试样全部转移至50 mL具塞塑料离心管中，以4 000 r·min-1离心10 min，取上清液，经0.45 μm微孔滤膜过滤后，待液相色谱测定。同时做试样空白试验。

2.1.3 色谱条件和系统适应性试验

采用Sepax GP-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm），流动相为1.5 g/L磷酸氢二铵溶液，波长为215 nm，流速为1.0 mL·min-1，柱温为25 ℃，进样量为20 μL。

取2.1.1项下对照品溶液，在2.1.3项色谱条件下进行分析。丙酸拖尾因子为0.97，理论塔板数（USP）为23 060。

2.1.4 方法专属性试验

丙酸标准溶液、阴性试样溶液以及阴性加标试样溶液色谱图见图1～图3。结果表明，该方法专属性好，选择性高。

图1 丙酸标准色谱图

图2 阴性试样色谱图

图3 阴性加标试样色谱图

2.2 分析方法验证

2.2.1 线性关系、检出限和定量限考察

分别精密吸取0.0，0.50，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0和10.0 μL 2.1.1项下对照品溶液，注入液相色谱仪，在2.1.3项条件下测定，得到峰面积与质量浓度的线性关系，拟合回归方程式，确定相关系数、最低检出限（S/N=3）和定量限（S/N=10），结果见表1。结果表明，丙酸在0～0.535 3 mg·mL-1质量浓度范围内线性关系良好，完全能够满足面包中其含量的测定。

表1 回归方程、相关系数、最低检出限、定量限

2.2.2 精密度考察

取2.2.1项下丙酸线性第4点对照品溶液，按2.1.3项下色谱条件重复进样6次，记录色谱图。以峰面积计算，其RSD为0.58%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.2.3 方法重复性考察

取编号为A的面包试样，按2.1.2项下方法制备6份供试品溶液进行色谱分析，计算残留量。丙酸残留量RSD值为0.69%，表明该方法重复性良好。

2.2.4 溶液稳定性考察

取制备好的编号为A的面包供试品溶液，按2.1.3项下仪器条件分别于0，4，8，12，16，20和24 h进样测定，记录色谱峰面积，计算丙酸RSD，为0.74%（n=7），表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.5 耐用性考察

取2.2.1项下线性第4点对照品溶液，分别采用不同柱温（24，25和26 ℃）、不同流速（0.9，1.0和1.1 mL·min-1）进行测定，研究仪器色谱行为的变化。以峰面积计，不同柱温条件下丙酸RSD为0.81%（n=3）；不同流速条件下丙酸RSD为0.72%（n=3）。表明在实际应用过程中色谱条件有微小变化时，面包中丙酸残留量测定条件较宽，测定结果不受影响，系统具有较好的耐用性。

2.2.6 回收率考察

表2 回收率试验结果

精密称取已测定含量的试样（编号：A），平行9份，置于100 mL烧杯中，加入适量丙酸对照品储备液，后按2.1.2，2.1.3项下条件操作，结果见表2。丙酸的平均回收率为99.96%，RSD为0.59%，表明该法具有良好的回收率，准确度符合要求。

3 讨论

3.1 检测波长和流动相的选择

试验为了保证丙酸具有适宜的精密度和灵敏度，且减少干扰，采用二极管阵列检测器对样品进行全波长扫描，根据对丙酸的紫外光谱图进行分析，重点考察了195，215和235 nm处的特征吸收图谱。在215 nm处，丙酸有最佳吸收。比较流动相1.5 g/L磷酸氢二铵溶液（pH 2.5，3.0和3.5）[4-5]，对色谱峰的影响。结果采用1.5 g/L磷酸氢二铵溶液（pH 3.0）等度洗脱，基线平稳，丙酸峰形得到很好的提高。

3.2 提取方式的选择

比较不同pH磷酸溶液（pH 2.5，3.0和3.5）[6-8]对丙酸提取能力的影响，发现经pH 3.0磷酸溶液超声浸提10 min，可将样品提取完全，系统的耐用性好。

3.3 样品含量测定

取20批不同厂家的面包试样，各3份，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，在2.1.3项色谱条件下测定，采用外标法以峰面积计算含量，结果见表3。

表3 试样含量测定结果（n=3）

测定了20个不同生产厂家的试样，丙酸的含量为0.270 2～1.277 9 g·kg-1，测定结果均符合GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[9]。通过比较丙酸含量测定结果，发现不同厂家间存在明显差异，其原因可能与原辅料的选取和生产工艺的控制有关。因此，食品生产者应严把原辅料进厂关，全面规范并提高生产工艺关键控制点及质量标准，杜绝过量添加现象，确保食品的安全、健康，从而能够更好地维护消费者舌尖上的安全。