水中铜绿假单胞菌显色培养基的初步应用

蒋曙光，曹琥靓

1. 上海市营养食品质量监督检验站（上海 200082）；2. 上海源本食品质量检验有限公司（上海 200082）

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）属于假单胞菌属，是一类致病性较低但抗药力强的菌，其普遍分布于自然界中，如泥土中、动植物上、正常人的皮肤上和肠道呼吸道中。

铜绿假单胞菌可以在水环境中生存很长时间，可引起人的腹泻等疾病，世界卫生组织和我国都将此菌作为瓶装饮用水的污染危害指示菌，日本和加拿大等国家已经对水的铜绿假单胞菌的存在作出限量规定；国际食品法典委员会（CAC）和欧盟成员国都明确作出了相应的规定，并指出在水中不得检出此菌[1-2]。因此，铜绿假单胞菌被认为是水源性致病菌，是危害人类健康的一大威胁[3]。

目前国内外检验标准中，使用CN假单胞菌选择性培养基并结合滤膜法是检测水中铜绿假单胞菌最常用的手段[3]，水样经过过滤后将滤膜移到CN假单胞菌选择性培养基上，于36 ℃培养48 h，若在滤膜上有褐色或产有荧光的菌落，需纯化培养后进一步生化鉴定，其检验过程繁琐，通常要耗时5～7 d。

针对我国的水质污染情况，为进一步加快和提高检验水样的效率，特别是大量水样现场检验，试验通过使用铜绿假单胞菌显色培养基结合滤膜法，24～48 h就可以完成铜绿假单胞菌的检验，与国标使用的培养基和检验过程比较，具有很大的优越性，可推广应用于瓶（桶）装水、水源水、城市二次供水等领域的铜绿假单胞菌的检验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标准菌株

铜绿假单胞菌（ATCC 9027，ATCC 27853）、荧光假单胞菌（ATCC13525）、大肠埃希氏菌（ATCC 25922）、粪链球菌（ATCC 29212）、金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、沙门氏菌（ATCC 14028）：美国菌种保藏中心。

1.1.2 仪器与试剂

密理博便携式过滤系统；密理博过滤膜0.45 μm；海尔生物安全柜；三洋SANYO MLS-3050型高压灭菌锅；VDRTEX-5型旋涡混合仪；PL230型梅特勒电子天平；超净工作台。

CN假单胞菌选择性培养基、乙酰胺液体培养基、金氏B培养基、API 20NE、铜绿假单胞菌显色培养基等试剂，北京陆桥技术有限责任公司。

据《中国农民工调研报告》显示，新生代农民工的受教育程度逐步提升，其受教育程度在农民工中的占比由20世纪80年代的小学教育水平为主，逐步过渡到90年代以初中教育水平为主，2000年后，这个群体中的高中生比重最大，到今天，新生代农民工多半接受了中专或大专教育，有的还接受了正规的大学教育。相比于老一代农民工，这些农民工在今天的信息时代，他们完全可以与城市同龄人一样，借助于现代手段和信息技术完全可以获取自己想要的不同知识，他们具有较强的信息获取能力，其运用的途径、手段和方式也多种多样，网络和自媒体成为其了解外部世界的常用手段，这些新生代农民工的知识获取和知识更新速度和能力都与城市同龄人一样。

1.2 方法

1.2.1 显色培养基的特异性测试

将铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、大肠埃希氏菌、粪链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌在营养肉汤中过夜复苏，挑取1环转种于铜绿假单胞菌显色平板，于36±1 ℃培养24 h，观察各个菌株在显色平板上的生长状况，测试显色平板的特异性。

1.2.2 显色培养基的抑菌性测试

将大肠埃希氏菌、粪链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌在营养肉汤中过夜复苏，分别制成104～105CFU菌悬液，涂布于显色平板，于36±1 ℃培养24 h，观察显色平板上的杂菌生长状况。

1.2.3 培养基灵敏度测试

将铜绿假单胞菌在营养肉汤中过夜复苏，挑取1环至10 mL灭菌盐水中，制成10-1CFU的菌悬液，然后对其进行十倍稀释，制成10-2～10-7CFU的菌液。用微量移液器移取100 μL分别涂布于铜绿假单胞菌显色培养基、CN假单胞菌选择性培养基和营养琼脂，置36℃生化培养箱中，24 h后对各个培养基上铜绿假单胞菌的数量计数。比较各个培养基的灵敏度。

1.2.4 过滤系统的使用

按要求将0.45 μ m密理博滤膜、250 mL无菌滤杯、滤器、真空泵等抽滤设备组合，对水样进行过滤。

1.2.5 加标水样测试

将铜绿假单胞菌在营养肉汤中过夜复苏，挑取1环至10 mL灭菌盐水中，制成10-1CFU的菌悬液，然后对其进行十倍稀释，制成10-5～10-7的菌液。各取0.2 mL菌液加入250 mL水样中，过滤检测，将滤膜移置铜绿假单胞菌显色培养基和CN假单胞菌选择性培养基上，在36±1 ℃培养箱中培养24～48 h，观察计数，比较两种培养基的检验效果。

1.2.6 实际水样的的检验

采集瓶（桶）装水、水源水、环境水和城市二次供水，共计100份，对其进行铜绿假单胞菌检验。将250 mL水用0.45 μm密理博滤膜过滤，可根据污染情况适当稀释，过滤检验，将滤膜移置铜绿假单胞菌显色培养基和CN假单胞菌选择性培养基上，在36±1 ℃培养箱中培养24～48 h，比较铜绿假单胞菌在这两种培养基的检出效果。

1.3 铜绿假单胞菌的鉴定

从滤膜上挑取1～5个可疑菌落，铜绿假单胞菌在显色培养基上呈蓝绿色、1～2 mm菌落，CN假单胞菌选择性培养基上呈褐色或有荧光的菌落。转种到营养琼脂（NA）平板上纯化培养，置36±1 ℃生化培养箱培养18～24 h。进行确证试验 。

氧化酶试验：取新配制的氧化酶试剂滴在干净滤纸上，用玻璃棒将纯化培养物涂布在滤纸上，显深蓝紫色的判为阳性反应。铜绿假单胞菌应为阳性反应。

金氏B试验：将纯化培养物转种于金氏B培养基上，于36±1 ℃生化箱培养24～120 h。每天从培养箱中取出观察是否产生荧光，将120 h内有荧光产生的记为阳性。

乙酰胺试验：将纯化培养物转种于乙酰胺培养基中，在36±1 ℃下培养过夜，后向培养物滴加1～2滴钠氏试剂，如出现砖红色现象则为阳性，反之为阴性。

最终的鉴定采用API 20NE生化鉴定条。

2 结果与讨论

2.1 铜绿假单胞菌显色培养基的特异性测试结果

2.1.1 显色培养基生长情况

如表1所示，铜绿假单胞菌在显色平板上生长较好，有蓝绿色菌落。荧光假单胞菌显色平板上为白色菌落。其他菌不能良好生长或被抑制，表明显色平板对铜绿假单胞菌有良好的特异性。

2.1.2 抑菌性测试

将大肠埃希氏菌、粪链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌在营养肉汤中过夜复苏，分别制成104～105CFU菌悬液，涂布于显色平板上都不能生长，证明显色平板可以有效抑制104～105CFU数量的杂菌。

2.1.3 培养基灵敏度测试

统计30～300 CFU之间的菌落数，使用SPSS统计分析软件进行方差分析，比较三种平板上菌落数。如表2所示，铜绿假单胞菌在三种培养基上的生长数量无显著差异（p=0.901＞0.05），显色平板能达到国标中使用的传统培养基（CN假单胞菌选择性培养基）的相同效果和灵敏度。

表1 各菌株在显色平板上的生长状况

表2 铜绿假单胞菌在三种平板的菌落数

2.2 加标水样测试

统计滤膜上30～300 CFU之间的菌落数，使用SPSS统计分析软件进行方差分析，比较两种培养基在滤膜上菌落数。如表3所示，铜绿假单胞菌在这两种平板滤膜上的生长数量无显著差异（p=0.716 0＞0.05），铜绿假单胞菌显色平板能达到国标中使用的传统培养基（CN假单胞菌选择性培养基）的相同效果和灵敏度。

表3 加标水样在滤膜上菌落结果

2.3 实际水样的的检验

如表4所示，试验采集瓶（桶）装水、水源水、环境水和城市二次供水，共计100份，其中桶装水样检出3株铜绿假单胞菌，水源水检出2株铜绿假单胞菌，环境水桶装水检出1株铜绿假单胞菌，其他水样的结果均是未检出。可疑水样通过过滤检验，滤膜上出现铜绿假单胞菌可疑菌落，经纯培养、初步鉴定、API 20NE鉴定试剂盒最终确认都是铜绿假单胞菌，两种培养基的检验结果相同，表明铜绿假单胞菌显色平板能达到国标中使用的传统培养基（CN假单胞菌选择性培养基）的相同效果。在实际检验中，铜绿假单胞菌显色培养基可在24 h就能观察结果，而CN假单胞菌选择性培养基则需要培养到48 h方可观察结果，在CN选择性培养基上还出现4株假阳性的菌株，这些菌经鉴定均是荧光假单胞菌，在显色培养基上为白色菌落，能够和铜绿假单胞菌在显色培养基上的蓝绿色菌落特征区分开，从而降低假阳性率。但在实际水样检验中未发现显色培养基有假阳性现象。

表4 实际水样检出铜绿假单胞菌的结果

3 结论

铜绿假单胞菌是水质监测重要指标之一，此菌能使人患病，被国内外水质标准[5]列为重要的致病菌项目，并规定了铜绿假单胞菌的限量。传统方法一般使用CN假单胞菌选择性培养基经48 h培养后初步鉴定、纯化、生化鉴定，检验周期太长，假阳性率很高。

因此，试验采用铜绿假单胞菌显色培养基经培养24 h可通过菌落的形态大小、颜色即可做出判断，大大节省了劳动力和时间，且其灵敏度、特异性测试均与传统培养基效果一致，样品检验假阳性率较低，检验效果很好。

由于试验采集的样本数量、种类有一定的局限性，只是对铜绿假单胞菌显色培养基的在水中检验初步应用做了一个介绍，还需要大量的实际样本数据对实验应用的支持和补充，但这一检验系统的建立对于铜绿假单胞菌的快速检验有重大意义，对国内水质检验标准的起草制定有一定的指导作用，可显著提高水质检验水平，提高保障饮水和供水的安全