大豆蛋白酶解物制备鸡肉风味基料

于亚辉，谢昭鹏，张帆，苏煌杰，方婷

福建农林大学食品科学学院（金山 350002）

中国的咸味香精发展历程可追溯至20世纪80年代，经过30余年的开发研究，形成一套具有鲜明区域特色与产品类型的工业化生产体系，其生产技术和研发水平也达到世界前列[1-2]。伴随着中国食品工业的高速发展，对于食品色、香、味等呈现日益多元化的追求，咸味香精的发展也将迎来新的机遇期[3]。

目前国内咸味香精的生产方式主要采用动植物蛋白及骨骼组织的酶解技术、脂肪调控氧化技术、美拉德反应技术、辛香料提取技术、调香技术及干燥技术等技术手段，生产出具备各种肉香味的咸味香精[3]。生产上以动植物蛋白酶解物、还原糖、氨基酸等风味前体物质为原料，经过热反应来生产风味基料，并经过加香调香从而达到商业水平，采用非肉源前体物质为原料生产的产品且成本较低，但其肉类特征香味较少且不够浓郁。

大豆分离蛋白（Soybean protein isolate，SPI），蛋白含量高，营养丰富，是一种全价植物蛋白，其酶解物可作为动物蛋白酶解物的替代物，但其不同的水解度、添加量、不同酶酶解产物等因素对产品品质影响较大。试验以大豆分离蛋白及鸡肉的酶解物为原料，经过热反应制备风味基料，研究大豆分离蛋白酶解物对制备鸡肉风味基料的影响，为采用植物蛋白酶解物制备风味基料及成品香精提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与设备

鸡胸肉（市售）。

大豆分离蛋白（蛋白质质量分数＞90%，安阳齐天生物技术有限公司）；风味蛋白酶（500 LA-PU/g）、复合蛋白酶（1.5 AU/g）均为丹麦诺维信酶制剂公司；动物蛋白酶（30万 U/g）、木瓜蛋白酶（200万U/g）均为南宁庞博生物工程有限公司；胃蛋白酶（3 000 U/g）、碱性蛋白酶（20万 U/g）、葡萄糖、甘氨酸、亮氨酸、精氨酸、硫胺素（VB1）、半胱氨酸均为西格玛试剂公司；酵母提取物（安琪酵母股份有限公司）；牛磺酸（潜江永安药业股份有限公司）；磷酸盐缓冲液（自制）。

精密电子天平（AX523ZH奥豪斯）；pH计（雷磁PHS-3C型，上海仪电科学仪器股份有限公司）；切碎机（广东小熊电器有限公司）；Centrifuge 5430 R小型高速冷冻式离心机（德国艾本德股份公司）；电热鼓风干燥箱（上海-恒科学仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅）。

1.2 方法

1.2.1 鸡肉酶解产物的制备

将鸡胸肉绞碎至肉糜，控制料液比1∶3（g/mL），采用分步加酶法：第一步加入底物质量0.2%的木瓜蛋白酶和风味蛋白酶，调节初始pH 6.0，于55 ℃恒温水浴锅中搅拌酶解2.0 h；第二步加入底物质量0.2%的复合蛋白酶和动物蛋白酶，调节初始pH 6.5，于50 ℃恒温水浴锅中搅拌酶解2.0 h，煮沸灭酶10 min，冷却后以6 500 r/min在4 ℃离心15 min后取上清液即得酶解产物，测得水解度为20.32%。

1.2.2 大豆分离蛋白酶解物的制备

使用去离子水配制浓度10.0%的大豆分离蛋白溶液250 mL，搅拌均匀，使用磷酸缓冲液及2 mol/L的NaOH溶液调节pH，分别采用碱性蛋白酶[4]、木瓜蛋白酶[5]、风味蛋白酶[6]、复合蛋白酶[7]、胃蛋白酶[8]进行酶解，酶解6 h，测定不同时刻的水解度，使用pH-stat法测定酶解液的水解度[9]，分别选择水解度为4.5%±0.1%，5.5%±0.1%，6.5%±0.1%，7.5%±0.1%和8.5%±0.1%的酶解液，冷冻室保存。

1.2.3 风味基料的制备

取鸡肉与大豆分离蛋白酶解产物共30 mL，依次按比例加入葡萄糖、甘氨酸、亮氨酸、精氨酸、硫胺素（VB1）、半胱氨酸、牛磺酸搅拌均匀，并使用磷酸盐缓冲溶液调节至pH 6.5，装入反应瓶后置于立式压力蒸汽灭菌器中，在100 ℃下进行反应55 min。

1.2.4 单因素试验

1) 大豆分离蛋白不同酶种类水解液对鸡肉风味基料的影响

按表1的基本配方，分别添加10 mL用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、胃蛋白酶酶解的酶解度5.5%±0.1%的大豆分离蛋白酶解液，其中添加鸡肉酶解液20 mL。

2) 木瓜蛋白酶水解的大豆分离蛋白其不同水解度鸡肉风味基料的影响

按表1的基本配方，分别加入10 mL水解度为4.5%±0.1%，5.5%±0.1%，6.5%±0.1%，7.5%±0.1%和8.5%±0.1%的大豆分离蛋白酶解液，其中添加鸡肉酶解液20 mL。

3) 木瓜蛋白酶水解的大豆分离蛋白其不同添加量对鸡肉风味基料的影响

按表1的基本配方，分别加入0，5，10，15，20和25 mL水解度5.5%±0.1%的大豆分离蛋白酶解液，并使用鸡肉酶解液补足30 mL。

4) 葡萄糖添加量对鸡肉风味基料的影响

按表1的基本配方，加入10 mL使用木瓜蛋白酶酶解的水解度5.5%±0.1%的大豆分离蛋白酶解液，20 mL鸡肉酶解液，并分别添加0，4.0%，4.5%，5.0%，5.5%和6.0%的葡萄糖。

5) 甘氨酸添加量对鸡肉风味基料的影响

按表1的基本配方，加入10 mL使用木瓜蛋白酶酶解的水解度5.5%±0.1%的大豆分离蛋白酶解液，20 mL鸡肉酶解液，并分别添加0，0.4%，0.8%，1.2%，1.6%和2.0%的甘氨酸。

6) 亮氨酸添加量对鸡肉风味基料的影响

按表1的基本配方，加入10 mL使用木瓜蛋白酶酶解的水解度5.5%±0.1%的大豆分离蛋白酶解液，20 mL鸡肉酶解液，并分别添加0，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%和1.2%的甘氨酸。

7) 精氨酸添加量对鸡肉风味基料的影响

按表1的基本配方，加入10 mL使用木瓜蛋白酶酶解的水解度5.5%±0.1%的大豆分离蛋白酶解液，20 mL鸡肉酶解液，并分别添加0，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%和1.2%的精氨酸。

8) 硫胺素添加量对鸡肉风味基料的影响

按表1的基本配方，加入10 mL使用木瓜蛋白酶酶解的水解度5.5%±0.1%的大豆分离蛋白酶解液，20 mL鸡肉酶解液，并分别添加0，0.02%，0.04%，0.06%，0.08%和0.10%的硫胺素。

9) 半胱氨酸添加量对鸡肉风味基料的影响

按表1的基本配方，加入10 mL使用木瓜蛋白酶酶解的水解度5.5%±0.1%的大豆分离蛋白酶解液，20 mL鸡肉酶解液，并分别添加0，0.03%，0.06%，0.09%，0.12%和0.15%的半胱氨酸。

10) 牛磺酸添加量对鸡肉风味基料的影响

按表1的基本配方，加入10 mL使用木瓜蛋白酶酶解的水解度5.5%±0.1%的大豆分离蛋白酶解液，20 mL鸡肉酶解液，并分别添加0，0.3%，0.6%，0.9%，1.2%和1.5%的牛氨酸。

表1 制备风味基料基本配方

1.2.5 正交试验优化工艺条件

根据大豆分离蛋白酶解液对制备风味基料的影响因素，并考虑单因素试验结果，选择蛋白酶种类（A）、水解度（B）、水解液添加量（C）、半胱氨酸添加量（D）4个因素进行正交优化，以感官评价为考虑依据，进行正交优化，因素及水平选取见表2。

表2 正交试验因素水平表

1.2.6 感官评价方法及评价标准

选取20名感官评价人员，对其进行感官评价的相关知识培训，并进行练习培训考核，从中选择10名感官评价人员对样品进行评价，每个样品交叉重复2～3次，评价标准见表3，满分100分，取10名评价人员的平均分数为最终结果。

表3 风味基料评价标准

1.2.7 模糊数学评价方法[5-6]

由10名感官评价人员组成评价小组，并按照感官评价手册对样品进行评价。根据样品实际情况，确定评判对象集为U=（u1，u2，…，ui，…，un），其中U为因素集，ui为第i个因素，根据评价小组根据风味基料的评价标准研究决定，选取5项指标组成因素集即U=（香味u1，色泽u2，逼真度u3，整体协调性u4，口感u5）；根据评判因素为V=（v1，v2，…，vi，…，vn），确定风味基料的评语集为V=（喜欢v1，一般喜欢v2，不喜欢v3，讨厌v4），感官评定表见表4；并确定因素集中指标相对应的权重向量为K=（0.25，0.20，0.25，0.15，0.15）。

表4 风味基料感官评定表

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

单因素试验结果见图1。

单一酶酶解大豆分离蛋白试验中，胃蛋白酶酶解的酶解液对制备风味基料具有最佳作用，原因可能在于胃蛋白酶选择性水解11S大豆球蛋白[10]，产生游离巯基及含有二硫键的小分子肽对生成含氮、氧、硫香味化合物起到促进作用。采用木瓜蛋白酶作为单因素试验酶，其酶解物作为风味基料反应液的最佳水解度为7.5%，木瓜蛋白酶选择性水解7S大豆球蛋白，随着水解度升高蛋白质水解为小分子肽，含有疏水性氨基酸及苦味氨基酸。植物蛋白酶解物的加入使得风味基料口感柔和香味协调浓郁，但随着加入大豆分离蛋白酶解物增加，非肉源前体物质增加产生的关键肉香味化合物减少，对风味基料的制备起到相反的作用，其最佳添加量为10 mL。采用10 mL木瓜蛋白酶酶解的大豆分离蛋白酶解液，其水解度为5.5%±0.1%与20 mL鸡肉酶解物为反应基料，确定单因素葡萄糖、甘氨酸、亮氨酸、精氨酸、硫胺素（VB1）、半胱氨酸和牛磺酸的最佳添加量分别为5.00%，1.20%，0.80%，0.60%，0.04%，0.06%和0.60%。

图1 单因素试验结果

2.2 正交试验优化工艺条件

试验结果和数据处理见表5和表6。

表5 正交试验结果

表6 方差分析表

由方差分析表5可知，F0.05＜F（蛋白酶种类）＜F0.01，F0.05＜F（水解度）＜F0.01，F0.05＜F（酶解液添加量）＜F0.01差异显著。

从表5和表6可知，4个因素中有3个因素对风味基料的综合评分具有显著影响（p＜0.05），对4个因素的极差R值进行分析为RB＞RC＞RA＞RD，其影响程度主次顺序为：B（蛋白酶种类）＞C（酶解液添加量）＞A（水解度）＞D（半胱氨酸添加量）。以综合评分为依据的较优方案为A3B2C1D3，即：选用胃蛋白酶水解、水解度7.5%±0.1%、酶解液添加量10 mL、半胱氨酸添加量0.12%。

2.3 模糊数学评价检验

对正交试验中得分在75分及以上的试验方案：A1B2C2D2（第1组）、A2B3C1D2（第2组）、A3B1C3D2（第3组）、A3B2C1D3（第4组）进行重复试验。对每个样品的品质指标进行归一化处理，得到模糊矩阵。

其中j=1，2，3，4为样品编号，i=1，2，3，4，5为样品的品质指标，ri1，ri2，ri3，ri4，ri5分别为第i个评价指标。依然选择当初的10名感官评价人员，再对4组样品依照风味基料感官评定表对样品逐一进行评价，其对应的票数情况见表7。

表7 感官评定票数分布

得到3组样品的模糊矩阵R11=V11/10。

2.4 模糊变换及评价结果

根据模糊矩阵变化原理R=K×A，4组样品的评价结果分别为R1=K×A1=K=（0.25，0.20，0.25，0.15，0.15）×A1=（0.23，0.325，0.325，0.09）；R2=K×A2=K=（0.25，0.20，0.25，0.15，0.15）×A2=（0.185，0.33，0.39，0.05）；R3=K×A3=K=（0.25，0.20，0.25，0.15，0.15）×A3=（0.16，0.365，0.33，0.095）；R4=K×A4=K=（0.25，0.20，0.25，0.15，0.15）×A4=（0.37，0.245，0.345，0.04）。

由4组样品的评价结果可知，第4组样品具有最高的隶属喜欢率为37%，讨厌率最少为4%，喜欢及一般喜欢率为61.5%是4组样品中最高的。根据最大隶属原则认为第4组样品的综合感官最佳，且模糊数学结果与正交试验的结果相一致，工艺条件为：选用胃蛋白酶水解、水解度7.5%×0.1%、酶解液添加量10 mL、半胱氨酸添加量0.12%。

3 结论

在一定酶解条件下的大豆分离蛋白酶解物，可代替部分鸡肉酶解物作为反应基物，加入一定比例的葡萄糖、甘氨酸、亮氨酸、精氨酸、硫胺素（VB1）、半胱氨酸、牛磺酸等前体物质，在一定条件下反应可得到具有一定品质的鸡肉风味基料。

通过单因素试验及正交试验对影响鸡肉味基料品质的因素进行研究，重点研究大豆分离蛋白酶解物的添加对鸡肉风味基料的影响，其中有较大影响的4个因素的主次关系是：蛋白酶种类＞酶解液添加量＞水解度＞半胱氨酸添加量，且前3个因素具有显著性。通过模糊数学感官评价方法确定正交试验最优反应条件为：选用胃蛋白酶水解、水解度7.5%×0.1%、酶解液添加量10 mL、半胱氨酸添加量0.12%，单因素试验条件为葡萄糖5.0%、甘氨酸1.2%、亮氨酸0.8%、精氨酸0.6%、硫胺素（VB1）0.04%、半胱氨酸0.06%、牛磺酸0.6%，得到的鸡肉风味基料品质较高，香味突出，为利用植物蛋白酶解液制备风味基料提供理论依据，并为研究采用复合酶酶解、提高水解度等因素对风味基料的影响提供借鉴。