多指标综合分析法优化杭白菊水提取工艺

高如意，邓辰辰，郭小莉，曹苗苗，张理兴，柏伟荣

1. 江苏康缘药业股份有限公司（连云港 222047）；2. 中药制药过程新技术国家重点实验室（连云港 222047）

菊花为菊科植物菊的干燥头状花序。9～11月花盛开时分批采收，阴干或焙干，或熏、蒸后晒干，药材按产地和加工方法不同，分为亳菊、滁菊、贡菊、杭菊。杭白菊，“浙八味”之一，为浙江桐乡地区的特产，杭白菊在中国有悠久的栽培历史，“杭白贡菊”一向与“龙井名茶”并提。菊花位列卫生部公布的药食同源目录中，食用安全性高，国家食品药品监督管理局数据库已获批的保健食品中，使用菊花为原料的产品超过300个，涉及的保健功能很多，包括抗氧化、辅助降血脂、缓解视疲劳等，可见菊花的药用价值和保健价值都很高。

菊花富含多种活性成分，研究表明菊花中主要含有黄酮、萜类及有机酸等化学成分[1-3]。关于菊花主要活性成分提取的研究较多，多为乙醇提取[4-5]，考察的指标为绿原酸或总黄酮单个指标，没有对总黄酮、绿原酸、多糖进行综合考察，而且，菊花作为保健食品原料时，多采取传统水提的方式，水提取工艺有较高的安全性。此外，菊花富含的绿原酸、总黄酮和多糖等多种成分有较好的水溶性，因此，试验以绿原酸、总黄酮、多糖为指标，采用正交设计[6-8]方法优选杭白菊水提取最佳工艺，为杭白菊在保健食品和普通食品领域的应用提供参考。

1 材料与仪器

UV-2700型紫外分光光度计（日本岛津）；高效液相色谱仪（戴安，Agilent，岛津）；粉碎机；电热套；Mili-Q超纯水仪（美国密理博公司）。

甲醇、苯、乙醇、硫酸、苯酚（分析纯，南京化学试剂股份有限公司）；乙腈（色谱纯）。

杭白菊（浙江，安徽广印堂中药股份有限公司，批号Y170311）；绿原酸（含量96.2%，批号110753-201415）、D-无水葡萄糖（含量99.9%，批号110833-201406）、芦丁（92.6%，批号100080-201609）均为中国食品药品检定研究院。

2 方法与结果

2.1 绿原酸检测方法

选用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂[6-8]，色谱柱为Waters C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30℃、流速1 mL/min，以乙腈-0.5%磷酸为流动相，经过调节两者比例，确定比例10∶90时供试品图谱中绿原酸峰形较好。

对照品溶液的制备：精密称取4.8 mg绿原酸于100 mL容量瓶，加50%甲醇定容，摇匀，作为母液。

供试品溶液的制备取：本品粉末（过四号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密称定，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W、频率35 kHz）30 min，放冷，摇匀，高速离心（12 000 r/min），取上清液，即为供试品。

2.1.1 线性关系考察

取绿原酸母液，加50%甲醇稀释配置成一系列浓度（4.829，9.659，19.317，28.976，38.634和48.293 μg/mL）的标准溶液，精密吸取对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积。结果表明，绿原酸在4.829～48.293 μg/mL范围内有良好的线性关系，回归方程为y=3×107x+7×106，R2=0.999 7。

2.1.2 精密度试验

精密吸取低、中、高3个浓度的对照品溶液和供试品溶液，连续重复进样6次，测得绿原酸峰面积积分值，计算，RSD值均小于2%。结果表明仪器精密度良好。

2.1.3 重复性试验

按2.1的供试品制备方法制备6份供试品，在2.1.1条件下分别进样，测定峰面积，计算得到RSD为0.48%（n=6），结果表明该法重复性良好。

2.1.4 稳定性试验

按2.1的供试品制备方法制备6份供试品，在2.1.1条件下分别于0，2，4，8，12和16 h各进样2次，测得绿原酸的峰面积积分值，计算得到绿原酸的峰面积RSD为0.20%，结果表明供试品溶液在16 h内稳定性良好。

2.2 多糖检测方法

粗多糖的含量按照《保健食品功效成分检测方法》中“粗多糖的测定方法”（硫酸-苯酚比色法）[9]规定的方法进行测定。

对照品溶液的制备：取D-无水葡萄糖适量约15.3 mg于100 mL量瓶中，用纯化水溶解并定容，制成每1 mL含D-无水葡萄糖0.15 mg的标准溶液，摇匀，即得对照品母液。

供试品溶液的制备：取杭白菊提取液1 mL于50 mL容量瓶中加水定容，摇匀，取5.0 mL移入50 mL离心管中，加入无水乙醇25 mL，4 ℃静置过夜，离心后留残渣，并用10 mL 80%的乙醇洗沉淀物（振摇打散沉淀），以4 000 r/min离心10 min，小心弃去上清液，重复洗沉淀物2次，热水溶解沉淀后转移至50 mL容量瓶中，冷却后定容，摇匀，即得。

2.2.1 线性考察

分别精密吸取D-无水葡萄糖母液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.8和1.0 mL于25 mL比色管中，加水至2.0 mL，加入5%苯酚试液1.0 mL，混合均匀后再加浓硫酸10.0 mL，于涡旋混合器中混匀，在沸水浴中加热2 min，取出置冰水浴中冷却，得标准系列溶液。于485 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线。结果表明，多糖在1.53～15.39 mg/L质量浓度范围内有良好的线性关系，回归方程为y=0.058 1x+0.000 5，R2=0.999 4。

2.2.2 精密度试验

按2.2.1条件下制作标准曲线，对照品溶液的精密度RSD为0.001 7%，供试品溶液的精密度RSD为0.35%，符合要求，说明仪器精密度好。

2.2.3 重复性试验

按2.2的供试品制备方法制备6份供试品，在2.2.1条件下分别进样，测定吸光度，计算得到RSD为1.65%（n=6），结果表明此法重复性良好。

2.2.4 稳定性试验

按2.2.1条件下制备供试品溶液，分别考察0，30，60，120，240和360 min条件下供试品的吸光度，供试品溶液的RSD为0.6%，表明供试品溶液在6 h内有较好的稳定性。

2.3 总黄酮检测方法

检测方法参考《保健食品检验与评价技术规范实施手册》（2003年版）中“保健食品中总黄酮的测定”。

对照品溶液的制备：取芦丁标准品适量，精密称定，加甲醇制备成每1 mL含总黄酮58.47 μg的标准品储备液。取芦丁标准储备液（58.47 μg/mL）0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL于10 mL比色管中，加甲醇至刻度，摇匀，于波长360 nm测定吸光度，绘制芦丁浓度和吸光度的标准曲线。

供试品溶液的制备：取杭白菊提取液1 mL于25 mL容量瓶中，加水定容，吸取1.0 mL，拌入1 g聚酰胺粉，搅拌均匀，70 ℃水浴烘干，聚酰胺粉转入层析柱。用20 mL苯洗脱，弃去苯液，静置2 h后，待苯液挥干后用甲醇洗脱并定容至25 mL，即得。

2.3.1 线性考察

取芦丁标准储备液（47.41 μ g/mL）0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL于10 mL比色管中，加甲醇至刻度，摇匀，于波长360 nm测定吸收值，绘制芦丁浓度和吸光度的标准曲线。结果表明，芦丁在4.74～23.71 μg/mL范围内有良好的线性关系，回归方程为y=0.029 6x-0.008 3，R2=0.999 5。

2.3.2 精密度试验

取标准品溶液（质量浓度9.482 0 μg/mL）于360 nm处测定吸光度，分别读取6次，标准品溶液的精密度RSD为0.14%，符合要求，说明仪器精密度好。

2.3.3 重复性试验

按2.3的供试品制备方法制备6份供试品，在2.3.1条件下分别进样，测定吸光度，计算得到RSD为0.48%（n=6），结果表明此法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验

取同一供试品，按照重复性方法制备1份供试品溶液在0，30，60，90，120和180 min时在360 nm下测定吸光度，样品溶液在180 min内吸光度无明显变化，RSD为0.72%，说明该方法稳定性好。

2.4 正交试验设计

杭白菊里主要活性成分绿原酸、总黄酮和多糖均有较好的水溶性，采用加热回流提取的方法，可以有效提取多种活性物质。参考前人研究，提取的料液比、加热时间、提取次数均对活性成分的提取率有较大的影响。因此，选取提取时间、提取溶剂量、提取次数为考察因素，每个因素选取3个水平，以杭白菊中绿原酸、总黄酮、粗多糖得率的综合评分为指标，对杭白菊提取工艺进行优化。

综合评价是利用数学方法（包括数理统计方法）[10-12]对一个复杂系统进行分析处理，是一种对多个指标、多个单位同时进行分析评价的方法。杭白菊里主要成分有多糖、总黄酮和绿原酸，目前菊花中多糖、绿原酸和总黄酮的现代医学研究都较多，试验利用总黄酮、绿原酸和多糖含量的提取率，并根据指标因素对提取工艺影响的贡献大小的差异，给予分配不同的权重系数，即多糖得率为0.33，绿原酸得率为0.34，总黄酮得率为0.33，再进行加权求和[13-15]，综合评分方法如式（1）。

取杭白菊9份，每份200 g，按L9(34)正交表进行试验，试验安排及结果见表1和表2，方差分析见表3。

表2 正交试验结果

表3 综合评分方差分析

由直观分析可知，各因素作用主次顺序为C＞A＞B。方差分析表明，因素C为主要影响因素，具有显著性差异，因素A、B则无显著性影响，确定最佳提取工艺条件选择A2B2C3，即加10倍量水提取2次，每次3 h。

2.5 正交试验验证试验

取6份杭白菊，每份200 g，其中3份分别加水10倍，提取2次，每次1 h；另外3组加水10倍，提取3次，每次1 h，验证试验结果见表4。

从验证试验可以看出，提取3次的总黄酮、绿原酸、多糖含量仅略高于提取2次，结合耗能、时间等因素，选择提取2次更为经济，在此条件下，多糖提取率为3.7%，绿原酸得率为0.2%，总黄酮提取率为2.3%。

表4 验证试验

3 讨论

通过单因素试验确定影响杭白菊中活性成分得率的3个主要因素为：提取次数＞提取时间＞料液比。其中提取次数有显著影响，采用综合评分的方法对3种活性成分赋权，运用正交设计试验方法得到的最佳提取条件为：加水10倍、提取2次、每次1 h。研究为杭白菊在保健食品领域的应用提供参考，杭白菊中的多糖能够起到增强免疫力、降血糖的作用；杭白菊中的绿原酸具有抗菌、解毒、利胆作用；杭白菊中黄酮类化合物不仅具有良好的消除自由基和抗氧化能力，而且具有明显的降低血脂和防动脉硬化的作用[16-17]，可见，杭白菊中主要活性成分有较好的保健功能。作为保健食品原料时，试验尚未对杭白菊的浓缩、干燥工艺进行研究，后续将开展深入研究。