Box-Behnken法优化人参皂苷Rg1、Re、Rb1提取工艺
2020-03-03赵立春刘继永
赵立春，刘继永
1. 中国农业科学院特产研究所（长春 130112）；2. 农业部特种动植物产品质量安全风险评估实验室（长春 130112）
人参（Panax ginseng C. A. Meyer）为五加科人参属植物，其干燥根或根茎是享誉海内外的滋补珍品，素有“百草之王”美誉。据现存最早的中医学专著《神农本草经》中记载：“人参，味甘微寒，主补五脏，安精神，定魂魄，止惊悸，除邪气，明目，开心益智。久服，轻身延年”[1-3]。经大量研究发现，人参化学成分较为复杂，药用价值巨大。人参皂苷作为主要活性成分，具有增强人体免疫、抗衰老、抗疲劳、治疗心血管疾病等功效[4]。随着先进仪器设备的使用，在其分离提纯与结构鉴定等方面取得了巨大的收获。由早前的煎煮、浸渍法等单纯物理提取，到超声、超临界提取法，再到多种仪器设备综合使用，先后建立30多种人参皂苷的提取方法，且在不断精进优化[5-12]。
超声提取人参皂苷方法简便安全、成本低、污染较小，提取效率较高，深受广大科研工作者的亲睐[13]。试验通过考察单因素对提取率的影响，设计Box-Behenken四因素三水平试验，优化人参皂苷提取工艺。
1 材料与方法
1.1 原料与试剂
人参（2017年9月采自吉林省万良市，经中国农业科学院特产研究所刘继永研究员鉴定，为5年生人参），于45 ℃恒温干燥箱烘干至恒重，粉碎，过60目筛。
三氯甲烷、乙醇（均为分析纯，国药）；甲醇、乙腈（均为色谱纯，美国Fisher）；人参皂苷标品Rg1（批号Z13O8L45576）、Re（批号B10M8S35243）、Rb1（批号Z16J9X52719）：上海源叶生物科技有限公司；超纯水，电导率为0.1～0.055 μ s/cm；等。
1.2 仪器与设备
液-质-质联用仪（美国Waters Xevo TQ）；十万分之一电子天平（梅特勒-托利多 XSA205DU）；数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DK-98-ⅡA电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）；多样品平行蒸发仪（瑞士步琦 Syncore）；电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；其他玻璃仪器（天津玻璃仪器厂）。
1.3 试验方法
1.3.1 人参皂苷供试品制备
精密称取5.000 g人参样品，用滤纸包好，放于索氏回流提取器中，加入三氯甲烷回流提取3 h。残渣挥干三氯甲烷。按照试验要求加入一定比例的提取溶剂，浸泡过夜，超声提取，过滤，弃去初滤液，精确量取25 mL滤液，减压浓缩近干，用甲醇溶解定容至100 mL，过0.22 μ m有机滤膜，备用。
1.3.2 人参皂苷含量测定
1.3.2.1 混合对照品溶液的制备
精密称取适量28种人参皂苷标准品，加入甲醇溶解配制成含人参皂苷Rg1 19.975 μg/mL、Re 19.396 μ g/mL和Rb1 19.4 μg/mL的混合对照品溶液。
1.3.2.2 色谱条件
色谱柱，ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相，乙腈（A），0.01%甲酸水（B）；流速，0.5 mL/min；柱温，35 ℃；样品温度，19 ℃；进样量，2 μL。梯度洗脱程序：0～4.4 min，19%～19% A；4.4～6.4 min，19%～21% A；6.4～8.8 min，21%～28% A；8.8～13.6 min，28%～31% A；13.6～21.6 min，31%～46% A；21.6～23.2 min，46%～54% A；23.2～25.44 min，54%～54% A；25.44～25.84 min，54%～95% A；25.84～27 min，95%～95% A；27～27.5 min，95%～19% A；27.5～30 min，19%～19% A。
1.3.2.3 质谱条件
离子源采用 HESI-源（Heated ESI-），载气N2，毛细管电压为-280 kV，锥孔反吹气体流量为50 L/h，脱溶剂气温度为450 ℃，脱溶气体流量为1 000 L/h，采用正负离子MRM扫描模式扫描分析，见表1。
表1 UPLC-MS操作质谱条件
1.3.2.4 线性关系的考察
精密吸取1.3.2.1小节中混合对照品溶液，用甲醇依次稀释成不同浓度梯度，以2 μL进样量检测，按一定采集条件，以浓度作横坐标（X），峰面积作纵坐标（Y），绘制标准曲线，得到28种人参皂苷的回归方程。
1.3.2.5 单因素试验
以人参皂苷Rg1、Re、Rb1提取率作响应值，控制单因素变量，依次考察提取溶剂及浓度（水饱和正丁醇，40%，50%，60%，70%和80%乙醇）、料液比（1∶30，1∶40，1∶50，1∶60和1∶70（g/mL））、超声功率（320，400，480，560和640 W）、超声温度（30，40，50，60和70 ℃）、超声时间（20，30，40，50和60 min）、超声次数（1，2，3和4次）对人参皂苷提取率的影响。
1.3.2.6 Box-Behenken法试验设计
综合单因素试验，根据Box-Behenken设计原理，设计四因素三水平试验表，即设计29个试验点，包括24个分析点和5个零点。精确称取5.000 g样品，选择试验因素及其水平值，分析结果，优化建立人参皂苷提取工艺。
2 结果与分析
2.1 标准品线性关系的考察（参见表2）
表2 人参皂苷的线性回归方程
2.2 单因素试验
2.2.1 提取溶剂对人参皂苷提取率的影响
按1.3.1小节操作步骤，以超声功率320 W、料液比1∶50（g/mL）、超声时间30min、超声温度30℃、超声2次为试验定量，考察水饱和正丁醇、乙醇（40%，50%，60%，70%和80%）对人参皂苷提取率的影响，结果见表3。当提取溶剂为70%乙醇时，3种皂苷的提取量最高，且色谱图峰形较好，响应值较高，无杂质峰干扰。故选定提取溶剂为70%乙醇。
表3 提取剂对人参皂苷提取率的影响
2.2.2 超声次数对于人参总皂苷提取率的影响
按1.3.1小节操作步骤，以70%乙醇作提取剂、超声功率320 W、料液比1∶50（g/mL）、超声时间30 min、超声温度30 ℃为试验定量，考察超声次数对人参皂苷提取率的影响，结果见表4。当超声次数为3和4次时，3种人参皂苷的提取率最高。但是由于超声4次时，与超声3次的差别太小，即浪费时间，成本又高。故选择超声3次作为试验条件。
表4 超声次数对人参皂苷提取率的影响
2.2.3 超声功率对人参皂苷提取率的影响
按1.3.1小节操作步骤，以70%乙醇作提取剂，超声3次，以料液比1∶50（g/mL）、超声时间30 min、超声温度30 ℃为试验定量，考察超声功率对人参皂苷提取率的影响，结果见表5。3种人参皂苷的提取率走势大致相同，当超声功率为480 W时，提取率达到最大值。故选择320，480和640 W作因素水平，对应编码值为-1，0和+1。
表5 超声功率对人参皂苷提取率的影响
2.2.4 超声温度对于人参皂苷提取率的影响
按1.3.1小节操作步骤，以70%乙醇作提取剂，超声3次，以超声功率480 W、料液比1∶50（g/mL）、超声时间30 min为试验定量，考察超声温度对人参皂苷提取率的影响，结果见表6。当超声温度为60 ℃时，3种人参皂苷的提取率最高。将温度的50，60和70 ℃作因素水平值，对应编码值为-1，0和+1。
表6 温度对人参皂苷提取率的影响
2.2.5 料液比对于人参皂苷提取率的影响
按1.3.1小节操作步骤，以70%乙醇作提取剂，超声3次，以超声功率480 W、超声温度60 ℃、超声时间30 min为试验定量，考察料液比对人参皂苷提取率的影响，结果见表7。当料液比为1∶50（g/mL）时，3种人参皂苷的提取率最高。将料液比1∶30，1∶50和1∶70（g/mL）作因素水平值，对应编码值为-1，0和+1。
2.2.6 超声时间对于人参皂苷提取率的影响
按1.3.1小节操作步骤，以70%乙醇作提取剂，超声3次，超声功率480 W、超声温度60 ℃、料液比1：50（g/mL）为试验定量，考察超声时间对人参皂苷提取率的影响，结果见表8。当超声时间为30 min时，3种人参皂苷的提取率最高。将超声时间20，30和40 min作因素水平值，对应编码值为-1，0和+1。
表7 料液比对人参皂苷提取率的影响
表8 超声时间对人参皂苷提取率的影响
2.3 工艺条件优化的响应面分析结果
根据表9安排试验，最终试验结果如表10所示。
表9 Box-Behenken法试验各因素水平
表10 Box-Behnken试验结果
利用SAS 9.2分析Box-Behnken试验所得出的3种人参皂苷提取率，进行多元回归拟合，得到人参皂苷提取率（Y）对于超声功率（X1）、超声温度（X2）、料液比（X3）和超声时间（X4）的多元二次回归方程。
2.3.1 人参皂苷Rg1的响应面优化
考察超声提取人参皂苷Rg1的影响因素及其交互作用对提取率的影响。
由表11可知，其预测模型的p＜0.001，表明影响极显著；其失拟项p=0.153 8＞0.05，不显著，说明其拟合较好，能够说明模型对真实值情况的模拟较为准确。综上，该预测模型可以用于人参皂苷Rg1的提取工艺的优化。所得到的多元二次回归方程为：Y=-23.66+0.207 5X1+0.499 6X2+8.881×10-2X3+0.206 2X4-3.75×10-5X1X2-6.25×10-6X1X3-3.75×10-5X2X3-5.0×10-5X1X4+5.0×10-5X2X4+3.75×10-5X3X4-1.681×10-3X12-4.148×10-3X22-9.03×10-4X32-3.411×10-3X42。R2=0.996 8，接近于1，模拟程度较好。
表11 人参皂苷Rg1响应面回归模型的方差分析
图1 各因素间交互作用对于人参皂苷Rg1提取率的响应曲面图
通过SAS 9.2软件响应面设计分析所得到曲面图，如图1所示。图1中①，②和③的交互作用对于人参皂苷Rg1的影响较大，其余影响较小。采用SAS 9.2软件计算所得，当超声功率为484 W，超声温度为60.3℃，料液比为1∶50.8（g/mL），超声时间为30.5 min时，人参皂苷Rg1含量为3.1 mg/g。
2.3.2 人参皂苷Re的响应面优化
由表12可知，其预测模型的p＜0.001，表明影响极显著；其失拟项p值为0.141 7，说明其拟合较好，能够说明模型对真实值情况的模拟较为准确。综上，该预测模型可以用于人参皂苷Re的提取工艺的优化。所得到的多元二次回归方程为：Y=-13.16+7.538×10-2X1+0.344 9X2+5.558×10-2X3+8.718×10-2X4+2.5×10-5X1X2-2.5×10-5X1X3-6.25×10-5X2X3-3.75×10-5X1X4-1.75×10-4X2X4-1.75×10-4X3X4-6.05×10-42.781×10-3-4.3×10-4-1.031×10-3。R2=0.941 2，接近于1，模拟程度较好。
表12 人参皂苷Re响应面回归模型的方差分析
图2 各因素之间交互作用对于人参皂苷Re提取率的响应曲面图
通过SAS软件响应面设计分析所得到曲面图，如图2所示。除图2中①对人参皂苷Re的影响较明显外，其余影响所形成曲面图形状大致相同，影响不大。采用SAS 9.2软件计算所得，当超声功率为492.32 W，超声温度为60.71 ℃，料液比为1∶52.05（g/mL），超声时间为31.59 min时，人参皂苷Rg1含量为2.45 mg/g。
2.3.3 人参皂苷Rb1的响应面优化
由表13可知，其预测模型的p＜0.001，表明影响极显著；其失拟项p=0.417 6，说明其拟合较好，能够说明模型对真实值情况的模拟较为准确。综上，该预测模型可以用于人参皂苷Rb1的提取工艺的优化。所得到的多元二次回归方程为：Y=-14.49+0.169 8X1+0.353 7X2+4.429×10-2X3+5.226×10-2X4-2.5×10-5X1+8.75×10-5X2X3-6.25×10-5X1X4-2.5×10-5X2X4-1.0×10-4XX-1.371×10-3X2+9.222×10-5-4.4×10-4-3416.47×10-4。R2=0.988 8，接近于1，模拟程度较好。
表13 人参皂苷Rb1响应面回归模型的方差分析
图3 各因素之间交互作用对于人参皂苷Rb1提取率的响应曲面图
通过SAS软件响应面设计分析所得到曲面图，如图3所示。图3中①，②和③图对人参皂苷Re的影响较明显，其余影响所形成曲面图较平缓，影响不大。采用SAS 9.2软件所得，当超声功率为484.96 W，超声温度为60.91 ℃，料液比为1∶52.73（g/mL），超声时间为32.19 min时，人参皂苷Rg1含量为3.44 mg/g。
2.4 提取工艺比较
根据Box-Behnken设计试验结果，最终得到3种人参皂苷Rg1、Re、Rb1的最佳提取工艺参数，其结果见表14。分析3种人参皂苷的提取条件，依据实际情况获得提取3种皂苷的实际参数。
表14 3种人参皂苷的提取工艺的比较
2.5 工艺验证试验
参照2.3小节，并按照1.3.2小节进行超高液相色谱-串联质谱检测，分别进行3批验证试验，结果见表15，真实的人参皂苷提取率与模型预测值RSD低于2.86%，说明试验的重复性较好。
3 结论
超声提取人参皂苷是现在较为常用的一种提取人参皂苷的方法，操作简便，耗时较短，成本低廉，能够满足现在实验室的人参皂苷的提取检测要求。以70%乙醇作提取剂，超声3次，当超声功率为480 W，温度为60 ℃，料液比为1∶50（g/mL），超声时间为30 min时，人参皂苷Rg1、Re、Rb1的提取率达到最高，分别为3.10，3.44和2.45 mg/g。且28种人参皂苷的回收率在82%～103%之间，回收率较好。该方法能够满足试验需求，同时为多种人参皂苷的提取提供了技术参考，又为人参工业化生产提供了理论参考。
