黑果枸杞中原花青素的提取及其咀嚼片的研制

于培良，田可，王倩倩，张俊瑶，赵立春*，裴栋

1. 广西中医药大学药学院（南宁 530001）；2. 中国科学院兰州化学物理研究所，中科院西北特色植物资源化学重点实验室/甘肃省天然药物重点实验室（兰州 730000）；3. 济宁医学院药学院（济宁 272013）

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）为茄科枸杞属灌木，生长于中国的青海、甘肃、宁夏、新疆、内蒙古及国外的南美洲，欧亚大陆温带地区[1]。最早在藏医中有入药的记载，藏医称为“旁玛”，味甘、性平，用于治疗心热病、心脏病、月经不调、停经等病症[2]。民间常生食或榨汁做饮料，具有滋补强壮、明目及降压作用[3]。现代研究表明，黑果枸杞含有丰富的矿物质元素[4]、维生素[5]、氨基酸等营养成分，以及较高的原花青素[6]、花色苷[7]、多酚[8]、多糖[9]、甜菜碱[10]等功效成分，素有“软黄金”之称[11]。其中原花青素是黑果枸杞的主要功效成分之一[6]，根据现代研究发现，原花青素具有抗衰老、抗肿瘤、抗癌变、预防心脑血管疾病、护肝、明目等功效[12-13]。试验开发一种黑果枸杞中原花青素的高速剪切提取工艺及其咀嚼片的配方制备工艺，以黑果枸杞提取物作为功能性成分，选择适当的辅料，研制出口感风味自然、营养丰富、易消化吸收、方便携带与食用，适宜快节奏生活的功能性食品黑果枸杞咀嚼片，并对其品质进行评价，该制备工艺稳定可靠，制备方法简单易行，具有良好的市场开发前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑果枸杞（内蒙古东汇生物科技有限公司），产地为阿拉善盟，经鉴定为茄科（Solanaceae）、枸杞属（Lycium）黑果枸杞的成熟果实。

原花青素（UV＞98%，上海源叶生物科技有限公司）；甲醇、正丁醇、盐酸、硫酸铁铵等均为分析纯；糊精、木糖醇、乳糖、麦牙糖、微晶纤维素、苹果酸、无水乙醇均为食品级。

1.2 仪器与设备

Fluko FA 25高速剪切分散乳化机（上海弗鲁克流体机械制造有限公司）；TDZ5-WS台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；LNGNF-101实验室膜分离设备（上海朗极膜分离设备工程有限公司）；Rotavapor R-3旋转蒸发仪（BUCHI公司）；T6新世纪紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；THP花篮式压片机（上海天祥·健台制药机械有限公司）；YD-1硬度测定仪（精科物光有限公司）；CJY-300 C脆碎度测定仪（精科物光有限公司）；电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；ZFD-9050真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；BSA 2245-CW分析天平（Sartorius公司）；HWS 26电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 浸膏得率测定

称取30 g黑果枸杞，加入一定量55%乙醇，用高速剪切机处理后，离心，上清液利用160 Da膜浓缩，用相应浓度的乙醇定容至100 mL，待测。精密量取20 mL溶液置于已干燥至恒质量的蒸发皿，水浴蒸至近干，于真空干燥箱中以45 ℃干燥12 h，置干燥器中冷却1 h，迅速称质量。按式（1）计算浸膏得率[14]。

式中：W为浸膏质量，g；M为黑果枸杞样品质量，g。

1.3.2 原花青素含量测定

1.3.2.1 标准曲线绘制

称取原花青素标准品10.0 mg定容于10 mL甲醇中，配制成1 mg/mL原花青素标准液。分别吸取原花青素标准液0，0.4，0.8，1.2，1.6和2.0 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。将正丁醇与盐酸按体积比95∶5混合后，取出6 mL置于具塞锥形瓶中，加入0.2 mL硫酸铁铵溶液和1 mL标准品溶液，混匀，置于沸水浴回流，精确加热40 min后，立即置于冰水中冷却，在加热完毕15 min后，于546 nm波长处测定吸光度[15-16]。

1.3.2.2 样品测定

精密称取适量样品固体，用甲醇定容于50 mL容量瓶中，得样品溶液。将正丁醇与盐酸按体积比95∶5混合后，取出6 mL置于具塞锥形瓶中，加入0.2 mL硫酸铁铵溶液和1 mL样品溶液，混匀，置于沸水浴回流，加热40 min后，立即置于冰水中冷却，在加热完毕15 min后，于546 nm波长处测定吸光度。

1.3.3 提取方法的优选

1.3.3.1 超声提取法

称取黑果枸杞5 g，加55%乙醇50 mL，超声提取5 min（175 W），过滤，滤液定容至100 mL，待测。

1.3.3.2 冷浸提取法

称取黑果枸杞5 g，加55%乙醇50 mL，冷浸5 min，过滤，滤液定容至100 mL，待测。

1.3.3.3 高速剪切法

称取黑果枸杞5 g，加55%乙醇50 mL，用高速剪切机处理5 min（10 000 r/min，50 ℃），离心，上清液定容至100 mL，待测。

1.3.4 单因素试验

称取30 g黑果枸杞，在料液比1∶10（g/mL），高速剪切机转速16 000 r/min条件下，以55%乙醇为溶剂，每次提取15 min，考察提取次数对原花青素提取率的影响。

称取30 g黑果枸杞，在料液比1∶10（g/mL），高速剪切机转速16 000 r/min条件下，分别以45%，55%，65%，75%和85%乙醇为溶剂提取15 min，考察乙醇体积分数对原花青素提取率的影响。

称取30 g黑果枸杞，在料液比1∶10（g/mL），高速剪切机转速16 000 r/min条件下，以55%乙醇为溶剂，考察时间对原花青素提取率的影响。

称取30 g黑果枸杞，在高速剪切机转速16 000 r/min条件下，以55%乙醇为溶剂提取15 min，考察料液比对原花青素提取率的影响。

称取30 g黑果枸杞，在料液比1∶10（g/mL），以55%乙醇为溶剂在不同转速条件下分别提取15 min，考察高速剪切机转速对原花青素提取率的影响。

1.3.5 正交试验优选提取工艺

根据单因素试验结果，结合实际使用情况考量，选择剪切速率、料液比、剪切时间和乙醇体积分数进行L9(34)正交试验，以浸膏得率、原花青素含量为评价指标，筛选最佳提取工艺。

1.3.6 咀嚼片的制备工艺流程

黑果枸杞→高速剪切提取→膜浓缩→真空浓缩→提取物→原料、辅料混合→制软材→制粒→干燥→整粒→压片→包装

1.3.7 黑果枸杞原花青素咀嚼片的感官评分

由10名营养与食品专业人员组成评定小组，分别对黑果枸杞原花青素咀嚼片进行评分，并计算总分。咀嚼片感官品质评分标准见表1[17]。咀嚼片应为色泽均匀一致，表面光滑有弹性，片剂成形性较好，酸甜可口，无苦涩味，入口柔顺，硬度和脆度适中。

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制

以原花青素质量浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：y=4.461 4x-0.004 5，R2=0.998 7。原花青素浓度在0～0.200 mg/mL范围内与吸光度线性关系良好。

图1 原花青素的标准曲线

2.2 提取方法的优选

分别考察超声法、冷浸法、高速剪切法提取黑果枸杞中原花青素，如图2所示，结果分别为1.285%，0.467%和2.039%。表明在相同时间内高速剪切法明显优于其他2种提取方法。

2.3 单因素试验结果

2.3.1 提取次数对黑果枸杞原花青素得率的影响

提取1次，2次，3次和4次后，原花青素得率分别为2.567%，2.692%，2.787%和2.833%，结果见图3。从节约成本考虑，提取次数定为1次。

2.3.2 乙醇体积分数对黑果枸杞原花青素得率的影响

如图4所示，随着乙醇体积分数增加，黑果枸杞提取物中原花青素得率先逐渐增大，后逐渐减少，在乙醇体积分数达到55%时，得率达到最大值，乙醇体积分数大于55%时，得率逐渐下降。可能是由于相似相溶原理，原花青素类化合物是大极性化合物，易溶于极性溶剂。乙醇体积分数增大时，溶剂的极性逐渐变小，从而导致原花青素的溶解度降低，因此，乙醇体积分数选择55%。该结果与许丹丹等[18]优化黑果枸杞中原花青素提取工艺的结果一致。

图2 提取方法对黑果枸杞原花青素得率的影响

图3 提取次数对黑果枸杞原花青素得率的影响

图4 乙醇体积分数对黑果枸杞原花青素得率的影响

2.3.3 提取时间对黑果枸杞原花青素得率的影响

由图5所示，随时间延长提取率上升，在15 min时达到一个较高值，而后原花青素含量随时间延长而有所下降。推测原因有二：一是时间延长增加色素、脂类和糖类等杂质的溶出，干扰测定结果；二是长时间的作用可能会破坏一些原花青素成分。故提取时间选择15 min为宜。

2.3.4 料液比对黑果枸杞原花青素得率的影响

由图6可知，料液比1∶10（g/mL）时，原花青素得率最高。可能随着料液比增大，单位体积内黑果枸杞颗粒浓度降低，相同时间内对单位质量黑果枸杞的处理次数减少，影响原花青素的溶出，且黏度也下降，减小液层摩擦力对植物细胞的破壁作用，使原花青素得率下降。

图5 提取时间对黑果枸杞原花青素得率的影响

图6 料液比对对黑果枸杞原花青素得率的影响

2.3.5 高速剪切机转速对黑果枸杞原花青素得率的影响

如图7所示，原花青素得率随转速增大而增加，19 000 r/min时达到最大值，而后随转速增加原花青素得率反而下降。可能是高速剪切引起的强劲的机械效应和气蚀作用，对原花青素聚合体有破坏作用，也增加了杂质溶出，使其得率下降。

图7 高速剪切机转速对黑果枸杞原花青素得率的影响

2.4 正交试验安排与结果

称取30 g黑果枸杞，按表2所列因素水平正交试验，将试样离心过滤，利用160 Da膜浓缩，定容，并按1.3.1和1.3.2的测定浸膏得率和原花青素得率。正交试验结果见表3，方差分析结果见表4。

根据表3极差分析可知，以原花青素得率为评价指标，各因素的影响依次为：剪切时间（C）＞剪切速率（A）＞料液比（B）＞乙醇体积分数（D）。由方差分析表4可知，提取剪切时间（C）、剪切速率（A）对原花青素得率具有显著性影响，而提取料液比（B）、乙醇体积分数（D）未产生显著性影响。通过对正交试验的结果分析，同时考虑到工业生产的成本、效率和剪切设备的损耗，得出黑果枸杞原花青素最佳提取条件为A2B1C3D1，即剪切速率19 000 r/min，料液比1∶8（g/mL）、剪切时间15 min、乙醇体积分数45%。

表2 正交设计各因素水平表

表3 正交试验设计表及结果（n=3）

表4 方差分析

2.5 验证试验

结果见表5，表明正交优化的提取方案可行。

表5 验证试验结果

2.6 黑果枸杞原花青素咀嚼片的制备

2.6.1 黑果枸杞原花青素提取物量的确定

黑果枸杞原花青素提取物在配方中所占比例越大，营养价值越高，但还需同时考虑咀嚼片的口味及成型效果，对20%～50%范围内调整其添加量进行压片试验，结果如表6所示。

结果表明，黑果枸杞原花青素提取物添加量40%时，制出的咀嚼片品质最好，入口顺滑，无苦涩味，软材易制粒，咀嚼片表面光滑，无黑色斑点。提取物添加量增加，由于黑果枸杞原花青素提取物的吸湿性较强，软材黏度较大，咀嚼片表面容易出现黑色斑点，而且会增加咀嚼片的苦涩味。

表6 黑果枸杞原花青素提取物添加量对咀嚼片的影响

2.6.2 填充剂的选择

咀嚼片中最常用的填充剂为淀粉、微晶纤维素和糊精，考察填充剂对咀嚼片的影响，结果见表7。

结果表明，仅使用微晶纤维素或淀粉时，制得的软材黏度较差，制出的咀嚼片硬度差。单独使用淀粉具有糊口感。单独使用糊精时，咀嚼片硬度太大。将微晶纤维素和糊精混合使用时，制得的软材黏度适中，无黏冲现象，咀嚼片硬度适中，无糊口感。

表7 填充剂的选择对咀嚼片的影响

2.6.3 填充剂比例的确定

考察微晶纤维素和糊精比例对咀嚼片品质的影响，结果见表8。

结果表明，微晶纤维素和糊精质量比1.5∶2时，制得的软材黏度适中，咀嚼片硬度适宜。

表8 微晶纤维素和糊精的比例对咀嚼片品质的影响

2.6.4 甜味剂比例的确定

考察木糖醇与甘露醇的比例对咀嚼片口感的影响，结果见表9。

结果表明，木糖醇与甘露醇质量比1∶2时口感稍有涩味，质量比3∶1和2∶1时口感较甜，1∶1时口感较好，无明显涩味，咀嚼时有凉爽感，适合黑果枸杞原花青素咀嚼片的制备。

表9 木糖醇与甘露醇的比例对咀嚼片口感的影响

2.6.5 苹果酸添加量的确定

苹果酸可以调节咀嚼片的口味，掩盖黑果枸杞原花青素提取物的苦涩味。考察苹果酸添加量对咀嚼片口感的影响，结果见表10。

结果表明，苹果酸添加量5%时，咀嚼片酸甜较协调，符合消费者的口味。

表10 苹果酸添加量对咀嚼片口感的影响

2.6.6 咀嚼片配方的优化

对咀嚼片的工艺配方，进行L9(34)正交试验优化，因素水平表见表11，正交试验结果见表12，方差分析结果见表13。

由表12可知，咀嚼片配方影响因素大小依次为：黑果枸杞原花青提取物量（A）＞木糖醇量（C）＞苹果酸量（D）＞微晶纤维素量（B）。由表13方差分析表可知，黑果枸杞原花青提取物量（A）、木糖醇量（C）对咀嚼片配方工艺具有显著性影响，而苹果酸量（D）、微晶纤维素量（B）未产生显著性影响。通过对正交试验的结果分析，同时考虑到黑果枸杞原花青素咀嚼片的功能，得出黑果枸杞原花青素咀嚼片最佳工艺配方为A2B1C3D1，即黑果枸杞原花青提取物40%、微晶纤维素15%、木糖醇10%、苹果酸2.5%。为验证结果的可靠性，选取最佳工艺条件开展黑果枸杞原花青咀嚼片的制备，3次平行试验得到实际平均感官评分为47分，最佳工艺条件下制成的咀嚼片呈紫褐色，表面光滑，色泽均匀一致，入口柔顺，酸甜协调，质量差异限度、硬度等均符合中国药典规定。

表11 正交设计各因素水平表 %

表12 黑果枸杞原花青素咀嚼片配方优化试验结果

表13 方差分析

3 品质评价

3.1 感官指标

表面光滑，形状完整，色泽均匀一致，酸甜可口，入口柔顺，硬度和脆度适中。

3.2 理化指标

原花青含量1.34%、黑果枸杞提取物40%、微晶纤维素15%、糊精20%、木糖醇10%、甘露醇10%、苹果酸2.5%。

3.3 微生物指标

成品中细菌总数≤200 CFU/g，大肠杆菌未检出，致病菌未检出。

4 结论

经单因素试验和正交试验得出利用高速剪切法提取黑果枸杞中的原花青素最佳工艺为：剪切速率19 000 r/min，料液比1∶8（g/mL）、剪切时间15 min、乙醇体积分数45%。黑果枸杞原花青素咀嚼片最佳配方为：黑果枸杞原花青提取物40%、微晶纤维素15%、糊精20%、木糖醇10%、甘露醇10%、苹果酸2.5%。产品口感细腻，酸甜可口，风味宜人，具有广阔开发价值和市场应用前景。