黑加仑酵素发酵工艺优化及其体外抗氧化性能

樊秋元，朱丹，牛广财*，魏文毅，朱立斌，张琪

1. 黑龙江八一农垦大学食品学院（大庆 163319）；2. 黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院（大庆 163319）

黑加仑学名黑穗醋栗（Ribes nigrum L.），又称紫梅或黑豆果，为虎耳草科茶藨子属多年生小灌木[1]。常见于我国黑龙江、吉林、新疆等地区，其果实为紫黑色小浆果，外形与蓝莓较为相似。黑加仑果实中含有丰富的花色苷、多酚类物质、维生素C等营养成分，具有保护视力、抗氧化、预防心脑血管疾病和癌症等保健功能[2]。

酵素是指使用水果、蔬菜、菌类以及食用性药材为原料，经过酵母菌等多种有益菌发酵后而得到的，含有丰富的酶类、维生素、矿物质及次生代谢产物等的功能性微生物发酵保健性食品[3-4]。酵素具有抗疲劳、抗衰老、清除自由基等功能[5]。通过有益微生物发酵产生的酵素中，超氧化物歧化酶含量增多，具有较好的抗氧化能力。超氧化物歧化酶（SOD）能够清除羟基自由基（OH·）、超氧阴离子自由基（O2-·）和过氧化氢等活性氧（ROS），是细胞防御系统中的主要抗氧化酶[6]。

目前，国内主要对葡萄、蓝莓、苹果、树莓、火龙果、桂圆等酵素发酵工艺进行了较深入研究[7-12]，但关于黑加仑酵素制备工艺的研究仍鲜见报道。以新鲜黑加仑果为原料，以高效活性酵母为发酵菌种，制备黑加仑酵素。以总抗氧化能力和SOD酶活力为评价指标，通过单因素及正交试验对其发酵工艺参数进行优化，并研究其最优发酵工艺条件下酵素产品的自由基清除能力，以期为黑加仑酵素的制备提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑加仑，购于黑龙江省尚志市亚布力北方小浆果种植专业合作社；安琪牌葡萄酒专用高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；白砂糖，市售；福林酚，国药集团；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，天津大茂化学试剂厂；SOD酶活力检测试剂盒、总抗氧化能力检测试剂盒，南京建成生物工程研究所。Pectinex XXL果胶酶（酶活10 000 U/mL），诺维信（中国）生物技术有限公司；有机酸标准品，美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

WS 108手持式折光仪，河北润联科技开发有限公司；HR 7633打浆机，飞利浦家庭电器（珠海）有限公司；电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司；EX 324电子分析天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司；TD5Z低速平衡离心机，金坛市城西春兰实验仪器厂；UV-1100紫外可见分光光度计，上海凌析达仪器；DRP-9082电热恒温培养箱，上海森信实验仪器有限公司；Angilent 1200高效液相色谱，美国安捷伦公司。

1.3 试验方法

1.3.1 黑加仑酵素制备工艺流程

黑加仑果→清洗、破碎→酶解→过滤→调糖→杀菌→冷却→接种→发酵→黑加仑酵素

1.3.2 部分操作要点

1) 酶解：黑加仑清洗破碎之后，经Pectinex XXL果胶酶在50 ℃下酶解2 h，果胶酶添加量按照2.0 mL/kg添加。

2) 调糖：在室温条件下，将白砂糖加入到黑加仑果汁中，混匀后通过手持糖度仪对其糖度进行测定，将其初始糖度调整至设定值。

3) 杀菌：采用超声波处理15 min对黑加仑果汁进行杀菌。

4) 菌种的活化：安琪葡萄酒专用高活性干酵母按与蒸馏水1∶10倍（g/mL）溶解，在30～32 ℃恒温水浴锅中活化30 min，备用。

5) 接种：在无菌室中，按试验设计要求的比例，对处理后的黑加仑果汁接入活化后的酵母菌。

6) 发酵：在试验设计的温度和时间等条件下，接种后的黑加仑果汁进行静置发酵，在发酵过程中和结束后分别测定产品的总抗氧化能力和SOD酶活力的变化。

1.3.3 发酵时间的确定

调整黑加仑果汁发酵初始糖度为18%，酵母菌接种量为0.03%，发酵温度28 ℃，发酵时间设定为24，48，72，96和120 h，测定总抗氧化能力和SOD酶活力的变化。

1.3.4 接种量的确定

调整黑加仑果汁发酵初始糖度为18%，分别向黑加仑果汁中接入0.01%，0.03%，0.05%，0.07%和0.09%的酵母菌液，于28 ℃条件下发酵72 h，测定总抗氧化能力和SOD酶活力的变化。

1.3.5 初始糖度的确定

调整黑加仑果汁发酵初始糖度分别为14%，16%，18%，20%和22%，酵母菌接种量为0.03%，于28 ℃条件下发酵72 h，测定总抗氧化能力和SOD酶活力的变化。

1.3.6 发酵温度的确定

调整黑加仑果汁发酵初始糖度为18%，酵母菌接种量为0.03%，分别在26，28，30，32和34 ℃条件下发酵72 h，测定总抗氧化能力和SOD酶活力的变化。

1.3.7 正交试验

依据单因素试验结果，以发酵时间、接种量、发酵液初始糖度和发酵温度4个因素进行L9(43)正交优化试验（表1），以总抗氧化能力和SOD酶活力为指标，确定黑加仑酵素的最佳发酵工艺条件。

表1 发酵条件优化正交试验因素水平

1.4 检测方法

1.4.1 黑加仑酵素总抗氧化能力的测定

将黑加仑酵素液以3 500 r/min离心10 min后，取上清液，根据总抗氧化能力试剂盒说明书进行总抗氧化能力的测定。

1.4.2 黑加仑酵素SOD酶活力的测定

将黑加仑酵素液以3 800 r/min离心10 min后，取上清液，根据SOD酶试剂盒说明书进行SOD酶活力的测定。

1.4.3 有机酸含量测定

Angilent 1200高效液相色谱检测的条件[10]：色谱柱，Supersil AQ-C185 μ m ID 4.6 mm×250 mm；流动相，0.02 mol/L KH2PO4溶液（用磷酸调pH 2.80）。液相条件：等梯度洗脱10 min；流速，1 mL/min；柱温，30 ℃；进样量，10 μL；检测波长，210 nm。样品用超纯水稀释10倍，用0.22 μm滤膜过滤后直接进样，每个样品重复3次。

1.4.4 黑加仑酵素超氧阴离子自由基清除能力的测定

取0.1 mL发酵液，加入4.5 mL的Tris-HCl溶液（pH 8.2），与0.4 mL的25 mmol/L的邻苯三酚溶液混匀，在25 ℃下水浴5 min，然后加入1 mL的8 mol/L的盐酸溶液，在325 nm波长下测定吸光度A1。空白对照以蒸馏水代替样液，测定吸光度A0。以同体积的蒸馏水代替邻苯三酚溶液，测定发酵液在体系中的吸光度A2。以4 mg/mL的VC为对照，按式（1）计算清除率：

式中：A0为空白的吸光度；A1为样液的吸光度；A2为样液在体系中的吸光度。

1.4.5 DPPH自由基清除能力的测定

取发酵液2 mL，离心取上清液并用蒸馏水稀释10倍得待测液。取2 mL待测液加入2 mL的0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，混匀避光放置30 min，在波长为517 nm处测吸光度为A1，用等体积的无水乙醇代替DPPH乙醇溶液，测吸光度为A2，将样品用等体积的无水乙醇代替，吸光度记A0。以4 mg/mL的VC为对照，按式（2）计算DPPH自由基清除率。

式中：A0为空白对照液吸光度；A1为样品测定管吸光度；A2为样品本底管吸光度。

1.4.6 羟自由基清除能力的测定

取10 μ L发酵液，加入2 mL 6 mmol/L的H2O2溶液、FeSO4溶液，摇匀静置10 min后，加入2 mL 6 mmol/L的水杨酸溶液，摇匀，37 ℃恒温水浴1 h，在510 nm下测定吸光度A1，以去离子水为参比溶液，测定吸光度A0，以同体积的蒸馏水代替水杨酸溶液，测定吸光度A2。以4 mg/mL的VC为对照，按式（3）计算羟自由基清除能力：

式中：A0为空白的吸光度；A1为样液的吸光度；A2为样液在体系中的吸光度。

1.4.7 其他指标测定

可滴定酸测定：GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》方法。菌落总数测定：参照GB 4789.2—2016《菌落总数测定》方法。大肠菌群数测定：参照GB 4789.3—2016《大肠菌群计数》方法。金黄色葡萄球菌检验：参照GB 4789.10—2016《金黄色葡萄球菌检验》方法。

2 结果与分析

2.1 发酵时间对黑加仑酵素的影响

发酵时间对黑加仑酵素总抗氧化能力和SOD酶活力的影响见图1。由图1可知，发酵96 h时总抗氧化能力达到最大值844.83 U/mL，之后下降；SOD酶活力在发酵第72 h达到4 869.80 U/mL，随后趋于稳定状态。因此，选择酵母菌发酵黑加仑酵素的较适合发酵时间为72～120 h。

图1 发酵时间对黑加仑酵素总抗氧化能力与SOD酶活力的影响

2.2 酵母菌接种量对黑加仑酵素的影响

酵母菌接种量对黑加仑酵素总抗氧化能力和SOD酶活力的影响见图2。由图2可知，接种量为0.07%时，总抗氧化能力最高，达到878.13 U/mL，SOD酶活力随着接种量的增加而缓慢增长，在接种量为0.07%时达到最大值4 245.26 U/mL，随后稍有下降。因此，确定酵母菌发酵黑加仑酵素的较适合接种量为0.05%～0.09%。

2.3 初始糖度对黑加仑酵素的影响

初始糖度对黑加仑酵素总抗氧化能力和SOD酶活力的影响见图3。由图3可知，初始糖度在16%～20%时总抗氧化能力较高，在18%时为最大值846.07 U/mL。SOD酶活力在初始糖度为16%～20%时也较高。因此，确定酵母菌发酵黑加仑酵素的较适合初始糖度为16%～20%。

图2 接种量对总抗氧化能力与SOD酶活力的影响

图3 初始糖度对总抗氧化能力与SOD酶活力的影响

2.4 发酵温度对黑加仑酵素的影响

发酵温度对黑加仑酵素总抗氧化能力和SOD酶活力的影响见图4。由图4可知，最适发酵温度范围为26～30 ℃，发酵温度在26 ℃时总抗氧化能力较高，为778.23 U/mL；SOD酶活力在发酵温度为28 ℃时较高，为3 979.80 U/mL。因此，选择黑加仑酵素的较适合发酵温度范围为26～30 ℃。

图4 发酵温度对总抗氧化能力与SOD酶活力的影响

2.5 黑加仑酵素发酵条件的正交试验结果

由表2的试验结果可知，4个因素对总抗氧化能力影响的主次顺序为A＞B＞D＞C，即发酵时间＞酵母菌接种量＞发酵温度＞初始糖度，试验最优组合为A2B3C3D1，即最佳发酵时间为96 h、酵母菌接种量为0.09%、初始糖度为20%、发酵温度为26 ℃；从对SOD酶活力影响情况看，其主次顺序为C＞D＞A＞B，即初始糖度＞发酵温度＞发酵时间＞接种量，试验最优组合为A2B2C3D2，即最佳发酵时间为96 h、酵母菌接种量为0.07%、初始糖度为20%、发酵温度为28 ℃。

表2 发酵条件的正交试验结果及分析

2.6 验证试验

由表3验证试验可知，正交最优组合A2B3C3D1总抗氧化能力为最高为887.25 U/mL，正交最优组合A2B2C3D2为880.60 U/mL，两种发酵条件下总抗氧化能力差异不大。但是，正交最优组合A2B2C3D2的发酵条件中SOD酶活力明显高于A2B3C3D1的4 778.54 U/mL。因此，黑加仑酵素酵素最佳的发酵工艺条件为：最佳发酵时间为96 h、酵母菌接种量为0.07%、初始糖度为20%、发酵温度为28 ℃。在此最佳工艺条件下进行验证试验，总抗氧化能力为880.60 U/mL，SOD酶活力为4 873.13 U/mL。

表3 最佳工艺条件验证试验

2.7 黑加仑酵素的品质指标

2.7.1 感官指标

色泽，深紫玫红色，均一有光泽；口味，细腻，微酸；香气，有黑加仑独特的香气；组织状态，液态均匀，有微量沉淀；杂质，无外来杂质。

2.7.2 理化指标

可溶性固性物含量，7.2%；总酸（以乳酸计），4.7%；总抗氧化能力值，880.60 U/mL，SOD酶活力，4 873.13 U/mL。

2.7.3 微生物指标

菌落总数为≤100 CFU/mL，大肠菌群数≤10 CFU/mL，致病菌未检出。

2.8 黑加仑酵素有机酸

黑加仑酵素有机酸HPLC结果如图5。由图5可知，8中标准有机酸分离效果很好，以各标准有机酸质量浓度对峰面积进行线性回归，采用外标法测定黑加仑酵素有机酸种类和含量。经测定得到黑加仑酵素有机酸种类主要为：柠檬酸（2 745.27 mg/L）、苹果酸（448.65 mg/L）、奎宁酸（188.89 mg/L）、莽草酸（23.48 mg/L）、抗坏血酸（19.59 mg/L）和草酸（19.59 mg/L）。有机酸是酵素发酵过程中改变其风味的重要因素，研究表明，有机酸种类会随着发酵的进行而改变，果蔬发酵代谢中积累了少量丙酮酸、富马酸和莽草酸，其中，莽草酸是多种有机酸代谢过程的重要产物[13]。

2.9 黑加仑酵素的超氧阴离子自由基清除能力

超氧阴离子自由基是活性氧自由基的一种，可以诱导脂类、蛋白质和核酸的氧化损伤[14]。由图6可知，黑加仑酵素发酵过程中超氧阴离子自由基清除能力在24 h内先呈急速上升的趋势，随着发酵时间的增加，超氧阴离子自由基清除能力呈缓慢下降趋势。虽然发酵后的黑加仑酵素清除能力要低于4 mg/mL的VC对超氧阴离子自由基清除率（87.78%），但是，发酵后产品对超氧阴离子自由基的清除能力均高于未发酵样品的清除率，这与发酵后酵素中的SOD酶活力增加有关，说明酵母菌发酵有利于黑加仑酵素的超氧阴离子自由基清除能力提高。

图6 黑加仑酵素发酵过程中超氧阴离子自由基清除能力的变化

2.10 黑加仑酵素的DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是一个较稳定的自由基，与其他测定方法相比较，DPPH可以短时间内评价抗氧化活性[15]，因此，被广泛应用于的抗氧化能力评价中。由图7可知，随着发酵时间的增加，黑加仑酵素DPPH自由基清除率呈上升趋势。在48 h时DPPH自由基清除能力达到了96.37%，要略高于4 mg/mL的VC对DPPH自由基清除率（95.80%）。

图7 黑加仑酵素发酵过程中DPPH自由基清除能力的变化

2.11 黑加仑酵素的羟自由基清除能力

羟自由基具有很强的氧化能力，羟自由基清除率是评估酵素抗氧化能力的另一个重要指标。由图8可知，黑加仑酵素发酵至72 h时，羟自由基清除率达到了最大值（70.54%），但要低于4 mg/mL的VC对羟自由基的清除率（73.21%）。

图8 黑加仑酵素发酵过程中羟自由基清除能力的变化

3 结论

试验采用单因素和正交试验对制备黑加仑黑加仑酵素工艺进行优化。结果表明，酵母菌发酵黑加仑酵素最佳发酵时间为96 h、酵母菌接种量为0.07%、初始糖度为20%、发酵温度为28 ℃。在此最佳工艺条件下，制备的黑加仑酵素总抗氧化能力为880.60 U/mL，SOD酶活力为4 873.13 U/mL，其有机酸主要种类为：柠檬酸（2 745.27 mg/L）、苹果酸（448.65 mg/L）、奎宁酸（188.89 mg/L）、莽草酸（23.48 mg/L）、抗坏血酸（19.59 mg/L）和草酸（19.59 mg/L）。该酵素产品对超氧阴离子自由基、DPPH自由基和羟自由基具有较好的清除能力，具有较好的抗氧化性能。