酶解海带蛋白制备抗菌肽的工艺优化

吴承燕，苏羽航，王艳君，刘冬梅，王靖

福建师范大学福清分校，食品软塑包装技术福建省高校工程研究中心，近海流域环境测控治理福建省高校重点实验室（福清 350300）

抗菌肽（Antibacterial peptide）又称抗微生物肽（Antimicrobial peptide），是一类具有抗菌活性的多肽，已在细菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物甚至人类中发现并分离，对细菌具有广谱高效的杀菌活性[1]。抗菌肽分子量小，不易产生耐药性，可用于农业、医药、食品等行业[2]。

海带属于褐子纲海带目海带科海带属，味道鲜美，营养价值高。近年来，对海带活性物质的酶解提取多集中在海带多糖、甘露醇、膳食纤维以及碘等方面[3-7]，而对海带蛋白以及活性肽的报道较少。李伟等[8]发现海带蛋白对大肠杆菌、产气杆菌、金黄色葡萄球菌具有抑制作用，并对高血压模型大鼠有一定的降压作用。蔡瑾[9]发现海带提取物对密执安棒形杆菌环腐亚种有抑菌作用。孟然[10]发现海带酶解物具有辅助降血糖、抗氧化和降血脂效果。温志鹏等[3]利用复合蛋白酶水解海带蛋白提取鲜味成分。

试验以pH、酶底比、酶解时间及酶解温度为影响因子，以大肠杆菌为指示菌，探究海带抗菌肽的抑菌效果，并在单因素试验的基础上，采用响应面法优化海带抗菌肽的制备工艺，为海带的深加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂、仪器与设备

海带蛋白、大肠杆菌（福建师范大学福清分校实验室保存）；碱性蛋白酶（南京奥多福尼生物科技有限公司）；牛肉膏（北京奥博星生物技术有限责任公司）；蛋白胨（北京奥博星生物技术有限责任公司）；琼脂；十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠、氢氧化钠、浓盐酸均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

YP 402 N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；DK-S 24电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；H-1850 R高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；LDZX-50 KBS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；SPX-150 B-Z生化培养箱（上海博业有限公司）；FD-IE台式冷冻干燥机（福州伍联医疗器械有限公司）；SW-C 5-1 FD双人垂直超净工作台（福州伍联医疗器械有限公司）；T 22 SP紫外可见分光光度计（上海棱光）。

1.2 碱性蛋白酶酶解海带蛋白

海带蛋白的制备参考吴凤娜等[11]的方法，并加以改进，冻干保存。取一定量的海带蛋白冻干粉溶于一定pH的磷酸钠缓冲液中，置于相应温度的恒温水浴锅中预热，加入碱性蛋白酶。酶解一定时间后95 ℃灭酶15 min，冷却至室温，于4 ℃、以12 000 r/min离心10 min，用0.22 μm滤膜过滤除菌后得到抗菌肽溶液，真空冷冻干燥保存备用。

1.3 抑菌率的测定

冻干粉溶于超纯水中，配制成质量浓度为1 mg/mL的抗菌肽溶液，抑菌率测定的方法参考姜太玲等[12]的方面，并进行一定的修改。

大肠杆菌活化后，挑取单菌落接种于5 mL牛肉膏蛋白胨培养基中，在37 ℃、180 r/min摇床中培养10 h后，按1∶20扩大培养，4 h后菌悬液浓度约为107CFU/mL。取4支灭菌试管，编号为a、b、c和d，4支试管分别加入200 μL菌悬液，a管和b管各加入1 mL超纯水，c管和d管各加入1 mL抗菌肽溶液。其中a管和c管置于4 ℃作空白对照，b管和d管置于37 ℃恒温培养，24 h后测定600 nm下吸光度A。每组试验各进行3次，取平均值。

1.4 单因素试验设计

1.4.1 酶解pH对海带抗菌肽抑菌率的影响

底物质量浓度为1 mg/mL，在酶底比为5%、酶解时间为4 h、酶解温度为45 ℃的条件下，pH分别为7，8，9，10，11和12时测定对大肠杆菌的抑菌效果，考察酶解pH对海带抗菌肽抑菌率的影响。

1.4.2 酶底比对海带抗菌肽抑菌率的影响

底物质量浓度为1 mg/mL，在酶解时间为4 h、酶解温度为45 ℃、pH为11的条件下，酶底比分别为2.5%，5%，7.5%，10%和12.5%时测定对大肠杆菌的抑菌效果，考察酶底比对海带抗菌肽抑菌率的影响。

1.4.3 酶解时间对海带抗菌肽抑菌率的影响

底物质量浓度为1 mg/mL，在酶底比为5%、酶解温度为45 ℃、pH为11的条件下，酶解时间分别为2，3，4，5和6 h，考察酶解时间对海带抗菌肽抑菌率的影响。

1.4.4 酶解温度对海带抗菌肽抑菌率的影响

底物质量浓度为1 mg/mL，在酶底比为5%、酶解时间为4 h、pH为11的条件下，酶解温度分别为35，40，45，50和55 ℃，考察酶解温度对海带抗菌肽抑菌率的影响。

1.5 响应面试验优化设计

在单因素试验的结果上，在pH 11的条件下，选取酶解时间、酶解温度、酶底比三个因素为自变量，以对大肠杆菌抑菌率为响应值，采用Box-Behnken设计原理进行响应面分析，并根据最佳条件进行验证试验。选取的因素水平及编码如表1所示。

表1 响应面试验因素和水平

1.6 数据处理

试验数据采用Origin软件和Design Expert软件进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 酶解pH对海带抗菌肽抑菌率的影响

不同pH对抑菌率的影响如图1所示。随着pH的升高，抗菌肽对大肠杆菌的抑菌率呈现先增加后降低的趋势，这与碱性蛋白酶的最适pH范围相符。pH过高或过低，都会影响碱性蛋白酶活性中心的构象，从而影响其与底物的结合，使酶与底物易于解离。在pH 11时抑菌效果最佳，抑菌率达到最大值，因此后续优化试验选择pH 11进行。

图1 pH对抑菌率的影响

2.1.2 酶底比对海带抗菌肽抑菌率的影响

不同酶底比对抑菌率的影响如图2所示。当底物质量浓度保持1 mg/mL不变时，随着碱性蛋白酶的增加，抑菌效果逐渐增强，在酶底比为10%时达到最大值，之后略有下降。酶浓度低，不足以让海带蛋白完全酶解，发挥其抗菌活性；加酶量过高，酶解反应速度过快，可能将部分多肽酶解成更小的肽段，丧失其抗菌活性。因此，控制酶底比7.5%，10%和12.5%进行优化试验。

2.1.3 酶解时间对海带抗菌肽抑菌率的影响

不同酶解时间对抑菌率的影响如图3所示。抑菌率随时间增加而缓慢增加，在5 h时达到最大值，之后抑菌效果下降。酶解时间太短，可能某些具有抑菌活性的氨基酸残基尚未暴露出来，无法充分发挥功能。酶解时间过长，抗菌肽被降解，导致抑菌率降低。因此，选择4，5及6 h作为优化试验的三个水平。

图2 酶底比对抑菌率的影响

图3 酶解时间对抑菌率的影响

2.1.4 酶解温度对海带抗菌肽抑菌率的影响

不同酶解温度对抑菌率的影响如图4所示。曲线呈现先上升后下降的趋势。酶解温度较低，未达到分子活化温度，酶与底物碰撞概率较低，底物被酶解的概率也相应较低；温度过高，虽然分子热运动速度增快，但酶内的一些次级键发生断裂，导致结构变化，影响催化效率。因此优化试验的酶解温度可选择35，40和45 ℃。

图4 酶解温度对抑菌率的影响

2.2 响应面试验结果

利用Design Expert软件对表2数据进行分析和处理，得到抑菌率与酶解时间（A）、酶解温度（B）和酶底比（C）的二次回归模型：Y=-29.29-0.76A+0.90B-2.45C+1.01AB+1.73AC+0.77BC-3.26A2-4.48B2-1.60C2。回归分析与方差分析结果如表3所示。该模型p＜0.000 1，表明具有极显著性，失拟项p=0.571 4＞0.05，表明模型的失拟项不显著，R2=98.25%，R2Adj=96.00%，表明模型与试验拟合良好，可以用此模型对抗菌肽抑菌效果进行分析和预测。影响抑菌率的各因素主次顺序为C＞B＞A。一次项中A、B影响显著，C影响极显著，二次项中BC影响不显著，AB影响显著，AC、A2、B2、C2影响极显著。

表2 响应面分析试验设计与结果

表3 回归模型显著性检验及方差分析

各交互作用对抑菌率的影响如图5～图7所示。响应面曲面坡度的陡峭或平缓程度反映出海带抗菌肽抑菌效果响应值的灵敏度。从曲面的坡度可知，酶解时间与酶底比、酶解时间与酶解温度交互作用明显，酶解温度与酶底比交互作用不明显，这与表3中的结果相符。

利用响应面法优化出海带抗菌肽制备的最佳工艺为酶解时间4.62 h、酶解温度39.86 ℃、酶底比7.55%，此条件下抑菌率的理论值为30.62%。鉴于试验操作的便利性，调整酶解时间为4.6 h、酶解温度为39.9 ℃、酶底比为7.6%，在此条件下进行3次平行验证试验，测得抑菌率的平均值为30.14%，与预测结果相差1.6%，说明采用响应面法优化海带抗菌肽制备的工艺条件准确可靠，通过试验所建立的模型可用于实际应用。

图5 酶解时间与酶解温度对抑菌率的影响

图6 酶解时间与酶底比对抑菌率的影响

图7 酶解温度与酶底比对抑菌率的影响

3 结论与讨论

试验以海带蛋白为原料，通过单因素试验与Box-Behnken响应面试验优化碱性蛋白酶酶解制备抗菌肽的工艺，预测得到的最佳参数为酶解时间4.6 h、酶解温度39.9 ℃、酶底比7.6%。在pH 11、底物质量浓度1 mg/mL的条件下，3次验证试验的平均值为30.14%，与预测值30.62%接近，表明采用响应面法具有一定的可行性。

试验仅以大肠杆菌为指示菌，后续工作会继续评价对其他细菌、真菌的抑菌效果，并对酶解产生的多肽成分进行分离纯化，通过结构测定确定其抗菌机理。在此试验基础上，可开发海带抗菌肽在食品、医药领域的应用，并为海带的加工利用提供新参考。