酶法制备花生源锌螯合肽工艺

李晨，布冠好，陈复生

河南工业大学粮油食品学院（郑州 450001）

锌是重要的微量元素，其含量仅次于铁。锌参与并组成人体内数百种功能蛋白和酶，人体的成长发育及免疫功能和脂类代谢等生命活动都离不开锌的作用。自然界中的锌来源广泛，十分充足，但人体对锌元素的吸收代谢却受到限制，致使人体无法摄入足够的锌。市面上一些补锌产品大多是无机盐添加剂类，如硫酸锌，由于这些产品不稳定，对胃肠道造成刺激[1]，所以不适合长期摄入。研究显示低分子量的可溶性有机化合物，如有机酸、氨基酸和多肽，在与锌离子螯合后，可以提高锌的生物利用度[2]。利用许多食物蛋白可以制备锌螯合肽，如芝麻蛋白[3]、乳蛋白[4]、牦牛酪蛋白[5]和牡蛎蛋白[6]。相较于无机锌盐，肽锌螯合物中的锌能被胃肠更好吸收[7]。

花生蛋白是一种优良的可食用性蛋白质，在植物蛋白中，其在营养方面和数量上仅次于大豆蛋白。花生蛋白质中90%是花生球蛋白和伴花生球蛋白，清蛋白占10%左右。它富含多种矿物质、微量元素、维生素及氨基酸，且易被人体消化吸收，有效利用率98%。中国花生产量巨大，榨油后的花生粕常作为饲料或直接作肥料用，致使花生蛋白并未得到充分利用，研究以花生粕作为金属螯合肽制备的蛋白质来源，具有一定意义。试验通过酶解花生蛋白，以花生蛋白水解物的锌螯合率为指标，从3种蛋白酶中筛选出制备金属螯合肽的适宜用酶，并优化蛋白酶酶促水解花生蛋白的工艺条件。由传统的花生蛋白领域向功能性花生肽领域拓展，为花生肽的金属螯合作用研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花生（远杂9102，河南省农科院）；碱性蛋白酶（1.8×105U/mL）、胰蛋白酶（2.4×105U/g，诺维信公司）；木瓜蛋白酶（80×104U/g，上海源叶有限公司）；硫酸锌（分析纯，天津市科密欧公司）；无水乙醇（分析纯，天津市天力公司）；硝酸（分析纯，洛阳市昊华公司）；高氯酸（分析纯，天津市鑫源公司）；其余试剂为国产分析纯。

1.2 设备与仪器

GL-10000 C高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器有限公司）；PHS-3 C酸度计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；SQP电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；LGJ-18型冷冻干燥机（北京四环科学仪器厂）；UV-1901型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；HH-6数显恒温水浴锅（常州普天仪器制造有限公司）；JJ-6六联电动搅拌器（常州普天仪器制造有限公司）；傅里叶变换红外光谱（北京瑞丽分析仪器有限公司）；ICE 3000火焰原子吸收光谱（赛默飞世尔科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 花生蛋白的制备

精选花生仁→低温烘干→脱红衣→脱衣花生仁→低温冷榨→低温冷榨饼→粉碎→低温脱脂→过筛→脱脂花生粕粉→去离子水（1∶10，g/mL）→1 mol/L NaOH溶液→调节pH 9.0→水浴搅拌（50 ℃）2 h→4 000 r/min下离心10 min→收集上清液→1 mol/L HCl溶液→调节pH 4.5→水浴搅拌（45 ℃）30 min→4 000 r/min下离心10 min→弃去上清液→收集沉淀→真空冷冻干燥→花生蛋白。

1.3.2 酶法制备花生肽

取一定量1.3.1制备的花生蛋白，加入适量去离子水，于90 ℃下搅拌预热10 min，冷却后，将烧杯置于恒温水浴锅中并控温加酶，不断搅拌下，使用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液保持体系pH不变，反应结束后，在沸水中加热10 min灭酶，冷却后，以4 000 r/min离心20 min，过滤，收集上清液并冻干，得到花生肽粉末[8]。

1.3.3 酶解产物水解度的测定

通过茚三酮比色法测定水解度[9]。

1.3.3.1 标准曲线的制作

甘氨酸在105 ℃条件下干燥3 h，配制成质量浓度分别为100，125，150，175，200和225 μg/mL的标准溶液。取1.0 mL甘氨酸溶液，加入1.0 mL 0.2 mol/L pH 8.04的磷酸盐缓冲溶液，加入1.0 mL的茚三酮显色剂，于90 ℃水浴锅中加热15 min，置于冷水中5 min，加水稀释至25 mL，于570 nm波长下测定吸光度。

1.3.3.2 酶解样品水解度的测定

将酶解样品稀释一定倍数后，以4 000 r/min离心15 min，取1.0 mL上清液，加入1.0 mL磷酸盐缓冲液和1.0 mL茚三酮显色剂，后续步骤同1.3.3.1。花生分离蛋白的上清液在相同条件下用作空白对照。

1.3.3.3 水解度（DH）计算

式中：N1为酶解样品的游离氮含量，mol/L；N0为花生分离蛋白原料的游离氮含量，mol/L；N总为样品总氮含量，mol/L。N1和N0根据甘氨酸的标准曲线及其相对分子质量计算；N总根据样品的蛋白含量计算。

1.3.4 花生肽锌螯合物的制备

取一定量1.3.2制得的冻干后的花生肽粉[10]，用去离子水配置为10 mg/mL的肽溶液，按体积比2∶1加入10 mg/mL的ZnSO4溶液，调节体系至pH 5.0，在60 ℃下充分搅拌1 h。

1.3.5 锌离子螯合率的测定

锌离子螯合率的测定采用原子吸收法（AAS）。

总锌含量测定时样品的处理方法：取1.3.4反应液5 mL，用去离子水定容至50 mL。

螯合肽锌含量的测定时样品的处理方法：另取1.3.4反应液5 mL，以5 000 r/min离心10 min除去杂质，上清液加入3倍体积的无水乙醇，充分混合均匀后以3 500 r/min离心15 min，弃去上清液，将沉淀用去离子水定容至50 mL。

锌螯合率的计算方法如式（2）。

1.3.6 最佳水解酶的选择

选用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶3种酶酶解花生蛋白，反应体系的底物浓度5%，加酶量5 000 U/g，酶解温度和pH分别为各酶的最适条件，水解不同时间（1，2，3，4和5 h）后获得水解产物，酶解过程同1.3.2，冻干，进行螯合反应，螯合过程同1.3.4，按照式（2）计算螯合率。各蛋白酶的最适酶解温度和pH如表1所示，考察水解时间与锌离子螯合率的关系。以锌离子螯合率为指标，筛选出最佳蛋白酶。

表1 酶解最适pH及温度

1.3.7 单因素试验

筛选出最佳酶后，对酶解条件的4个因素（底物浓度、酶解时间、酶解pH、酶解温度）进行单因素优化，考察单一因素对反应的水解度（DH）及螯合率的影响。

1.3.7.1 底物浓度对水解度及螯合率的影响

配制底物浓度分别为1%，3%，5%，7%和9%的花生分离蛋白溶液，酶解时加酶量5 000 U/g、pH 6.5、温度45 ℃、时间4 h，酶解过程同1.3.2，螯合过程同1.3.4，酶解之后测定花生分离蛋白酶解液的水解度和锌螯合率。

1.3.7.2 pH对DH及螯合率的影响

配制底物浓度5%的花生分离蛋白溶液，加酶量5 000 U/g、酶解温度45 ℃、时间4 h，控制酶解时的pH分别为6.0，6.5，7.0，7.5和8.0，酶解过程同1.3.2，螯合过程同1.3.4，酶解之后测定花生分离蛋白酶解液的水解度和锌螯合率。

1.3.7.3 酶解温度对DH及螯合率的影响

配制底物浓度5%的花生分离蛋白溶液，加酶量5 000 U/g、pH 6.5、时间4 h，控制酶解温度分别为40，45，50，55和60 ℃，酶解过程同1.3.2，螯合过程同1.3.4，酶解之后测定花生分离蛋白酶解液的水解度和锌螯合率。

1.3.7.4 酶解时间对DH及螯合率的影响

配制底物浓度为5%的花生分离蛋白溶液，加酶量5 000 U/g、pH 6.5、酶解温度45 ℃，控制酶解时间分别为1，2，3，4和5 h，酶解过程同1.3.2，螯合过程同1.3.4，酶解之后测定花生分离蛋白酶解液的水解度和锌螯合率。

1.3.8 正交试验

在单因素试验的基础上，采用正交法对酶解蛋白工艺条件进行优化。以螯合率为指标，采用四因素三水平的正交分析法设计试验。

1.3.9 数据处理与分析

试验中所有数据重复测定3次，结果用平均值±标准差表示。采用SPSS 16.0软件进行数据显著性分析，采用Origin 8.5软件绘图。

2 结果与讨论

2.1 蛋白酶的筛选

图1～图3分别表示碱性蛋白酶，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶对花生蛋白酶解物的水解度及其锌螯合率的影响。

由图1～图3可知，3种酶作用的水解液都具有螯合能力。随着水解时间变化，3种酶解液的水解度都逐渐上升后下降或趋于稳定，螯合率也随着时间延长而升高，碱性蛋白酶在其酶解3 h时，螯合率达到最高为44.77%；木瓜蛋白酶在其酶解3 h时，螯合率达到最高为45.14%；胰蛋白酶在其酶解2 h时，螯合率达到最高为49.81%。即胰蛋白酶水解物的锌螯合率明显高于碱性蛋白酶水解物和木瓜蛋白酶水解物，这是因为3种酶的酶解反应条件不同，且各酶都具有专一性，不同的酶切位点导致产物肽的C末端、N末端的氨基酸组成及排列各不相同，进而导致肽段的活性有所不同[11]，使得花生肽的金属螯合能力有强弱差别。综合分析，在较短时间内，胰蛋白酶水解物的锌螯合率较高，因此选择胰蛋白酶为最佳水解酶。

图1 碱性蛋白酶对花生蛋白DH和肽锌螯合率的影响

图2 木瓜蛋白酶对花生蛋白DH和肽锌螯合率的影响

图3 胰蛋白酶对花生蛋白DH和肽锌螯合率的影响

2.2 单因素试验

2.2.1 底物浓度对DH及螯合率的影响

图4表示在不同底物浓度条件下，花生蛋白酶解液的水解度与肽锌螯合率的变化。

在不同底物浓度条件下，花生蛋白酶解液的水解度与肽锌螯合率的变化如图4所示。在反应初始阶段，水解度和螯合率都随着底物浓度的升高而处于上升状态，底物浓度5%时，DH和螯合率达到最大值，螯合率为48.62%；底物浓度大于5%后，DH和螯合率都呈现下降的趋势。原因可能是底物浓度1%时，水解度较低，同时造成肽段数量减少，螯合率较低，增加底物浓度后，花生蛋白分散均匀，与蛋白酶接触更充分，有利于水解反应的发生，与锌离子配位的肽段数量增加，从而螯合率上升[12]；底物浓度过大，蛋白酶分子的扩散受到抑制，进而影响水解度和螯合率。结合生产成本，选择底物浓度5%为最优酶解条件。

图4 底物浓度对花生蛋白DH和肽锌螯合率的影响

2.2.2 pH对DH及螯合率的影响

图5表示在不同pH条件下，花生蛋白酶解液的水解度与肽锌螯合率的变化。

pH会影响蛋白酶的活力，从而影响水解效果[13]。由图5可知，pH 6～8，水解度先上升后趋于平缓；随着pH增加，螯合率先上升后下降，pH 6.5时螯合率达到最大为48.01%。这可能与胰蛋白酶的最适pH有关，反应体系pH过高或过低时都会导致酶的生物活性降低，造成水解度变化，而螯合率与水解度具有一定关系，因此确定pH 6.5为最优条件。

图5 pH对花生蛋白DH和肽锌螯合率的影响

2.2.3 酶解温度对DH及螯合率的影响

图6所示在不同酶解温度条件下，花生蛋白酶解液的水解度与肽锌螯合率的变化。

DH和螯合率随温度变化趋势明显，酶解温度40～60 ℃时，水解度成波动变化，但螯合率先增大后减小，45 ℃时螯合率最高，达到48.41%，这可能是因为胰蛋白酶具有最适温度，在该温度下，底物与蛋白酶的接触频率增大，能使充分发生反应[14]，低于或高于该温度，酶的活性会受到影响，作用效率降低，从而影响水解度。螯合率与水解度间存在一定相关性，在一定范围内（40～45 ℃），螯合率与水解度成正相关，因此，酶解温度45 ℃时为最适温度。

图6 酶解温度对花生蛋白DH和肽锌螯合率的影响

2.2.4 酶解时间对DH及螯合率的影响

图7所示在不同酶解时间条件下，花生蛋白酶解液的水解度与肽锌螯合率的变化。

在不同酶解时间条件下，花生蛋白的水解度呈逐渐上升后趋于稳定趋势，同时，螯合率先上升后缓慢下降，在2 h时具有最高螯合率，达到49.81%，说明在低水解度也可以有较高螯合率。这与Khantaphan等[15]利用碱性蛋白酶及风味蛋白酶酶解褐色条纹肌红鲷鱼蛋白酶解液，在低水解度亦有较高金属螯合率的研究结果相符，综合确定酶解时间为2 h。

图7 酶解时间对花生蛋白DH和肽锌螯合率的影响

2.3 正交试验结果及分析

在单因素试验基础上，通过正交法优化酶解反应的工艺条件。正交试验因素水平表如表2所示，试验方案及结果如表3所示。

由表3可知，这4个因素对螯合率影响的主次顺序依次是D＞C＞A＞B，即酶解温度＞pH＞酶解时间＞底物浓度。最佳酶解条件为A2B1C1D3，即取底物浓度3%、温度50 ℃、pH 6，反应时间2 h，在此条件下进行验证试验，锌离子螯合率为52.71%，高于正交试验中的结果，可确定该组合为最优组合。

表2 正交试验因素水平表

表3 正交试验方案及结果

3 结论

试验以花生为原料，分别用碱性蛋白酶，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶解花生蛋白，研究花生蛋白酶解产物锌螯合率，获得胰蛋白酶作为制备花生源锌螯合肽的最佳酶。在单因素试验基础上，基于螯合率采用正交试验设计优化制备花生肽的酶解工艺。正交试验表明，酶解温度对螯合率影响最大，其次依次是pH，酶解时间和底物浓度。最佳酶解条件为：底物浓度3%、酶解温度50 ℃、pH 6、酶解时间2 h。在此条件下，花生肽的锌螯合率为52.71%。研究对于拓宽花生肽的功能特性及新型补锌剂开发具有参考价值。