抗新城疫-禽流感二联卵黄抗体冻干粉剂的制备及应用

钱景富，贺永明，杨柏松，王 晶，王雅华,*

（1.辽宁农业职业技术学院，辽宁 营口 115009；2.辽源市东丰县东丰镇畜牧站，吉林 辽源 136300；3.青岛易邦生物工程有限公司，山东 青岛 266032）

鸡新城疫（ND）和禽流感（AI）仍是制约我国养鸡行业健康发展的主要传染病，常以单独或混合感染的方式感染家禽，发病率和死亡率都很高，对养鸡业危害严重。目前对这两种传染病尚无有效药物治疗，采取被动免疫是一种有效的措施，我国已有卵黄抗体（IY）上市，对防治ND和AI发挥了重要作用。现有的商品化IgY主要是液体制剂，通过注射方法使用，注射时鸡群易受到抓鸡惊吓导致应激综合症，连续注射针头更换不及时也易造成交叉感染导致疾病传播，同时免疫注射工作量大，费时费力，劳动力成本增加，如果操作不正确，会造成注射部位感染化脓、产生肿块、形成肉瘤、造成跛行等等，甚至会引起死亡。因此本研究在IgY剂型、使用途径上进行创新研究，制备IgY冻干粉剂，通过拌料或者饮水方式免疫，更适合现代规模化鸡场使用，减少免疫注射带来的弊端。为此我们进行了抗新城疫-禽流感（H5、H7、H9）多价二联卵黄抗体冻干粉剂的研制及口服应用试验。

1 试验材料

1.1 试验动物

20日龄健康雏鸡10只，要求新城疫和禽流感HI效价均小于3lg2；100日龄鸡新城疫和禽流感免疫健康蛋鸡80只。

1.2 免疫疫苗

新城疫一禽流感H9亚型二联灭活苗、重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株），均购自市场上正规流通合格产品。

1.3 主要试剂

鸡新城疫血凝抑制试验（HI）标准抗原和标准阳性血清、禽流感H9亚型HI标准抗原和标准阳性血清、禽流感H7亚型HI标准抗原和标准阳性血清（H7N9 H7-Re1株）、禽流感H5亚型HI标准抗原和标准阳性血清（Re-8株）、生理盐水、l%红细胞悬液、硫乙醇酸盐培养基（T.G）、酪胨琼脂（G.A）、葡萄糖蛋白胨汤（G.P）、正辛酸、甲醛、吐温-80等。

2 试验方法

2.1 强化免疫

对免疫蛋鸡群进行3次加强免疫。每隔2周进行1次强化免疫，免疫疫苗为新城疫一禽流感H9亚型二联灭活苗和重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株），肌肉注射。

2.2 抗体效价检测

第3次免疫后7 d收集卵黄，通过HI检测ND与AI卵黄抗体效价，当新城疫和禽流感H9亚型抗体效价达12lg2、禽流感H7亚型（H7N9 H7-Re1株）和禽流感H5亚型（Re-8株）抗体效价均在10lg2及以上开始收集高免鸡蛋。

2.3 卵黄抗体制备

2.3.1 收集卵黄

将合格的高免蛋用清水洗净，然后置0.1%新洁尔灭溶液中浸泡15 min，取出晾干。除去蛋清和系带，收集蛋黄，充分搅拌使蛋黄呈均匀膏状。

2.3.2 萃取

将收集的卵黄加入8倍体积的PH4.2的注射用水，搅拌混匀后，4～8℃静置24h，低温离心分离上清液，收集于灭菌容器中。

2.3.3 灭活

将收集的上清液，加入辛酸至终浓度为0.02%，搅拌混匀，室温放置2～4h灭活。最后按终浓度为0.05%加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，室温密封24h，再次灭活。

2.3.4 除菌过滤

用0.22μm微孔滤器过滤除菌。

2.3.5 冷冻干燥

加入吐温-80和蔗糖作为稳定剂，放入冷冻真空干燥机进行冻干。

2.4 卵黄抗体质量检验

2.4.1 物理性状

白色微黄色干粉。

2.4.2 无菌检验

在无菌条件下进行，将卵黄抗体冻干粉稀释10倍，取1mL接种于T.G培养基小瓶，37℃培养，3 d后移植T.G、G.A小管各2支，每支0.2 mL，置37℃、25℃各一支；再取样品0.2 mL直接接种G.P小管1支，置25℃。均培养5 d。观察是否有细菌生长。

2.4.3 安全检查

用20日龄健康易感雏鸡10只，每只鸡口服10个使用剂量，观察2周。观察雏鸡精神状态和死亡情况。

2.4.4 效力检验

用HI检测鸡新城疫和禽流感抗体效价。

2.5 抗体粉临床应用效果观察

将抗新城疫、禽流感（H5、H7、H9）多价二联卵黄抗体在蛋鸡和肉鸡中进行应用试验，观察其临床效果。

3 试验结果

3.1 卵黄抗体质量检验

3.1.1 无菌检验

鸡新城疫-禽流感二联卵黄抗体接种T.G、G.A和G.P培养基培养，均无细菌生长。

3.1.2 安全检查

口服鸡新城疫-禽流感二联卵黄抗体的雏鸡连续观察2周，未见异常表现，全部健活。

3.1.3 效力检验

ND抗体效价平均为13.75lg2，AIH9抗体效价平均为12.50lg2，AIH7（Re-1株）抗体效价平均为10.25lg2、AIH5（Re-8株）抗体效价平均为10.725lg2。

3.2 抗体临床应用效果

临床应用抗鸡新城疫-禽流感（H5、H7、H9）二联卵黄抗体结果显示，该卵黄抗体对ND和AI防治效果显著。治疗时采用饮水方式添加，发病早期使用二联卵黄抗体后可控制感染鸡群不再发病；发病中期，使用抗体治疗1次感染鸡群死亡率得到控制，连续使用2次抗体治疗，第4 d基本痊愈；发病晚期鸡群使用卵黄抗体治疗效果不明显。治疗使用剂量雏鸡每只鸡0.10g～0.15g，青年鸡每只鸡0.15g～0.20g，体重在2.5 kg以上的鸡使用剂量为0.20g～0.25g；紧急预防采用拌料方式添加，根据体重每只鸡使用剂量在0.10g～0.20g之间，使用1次抗体即可，还要进行疫苗接种，产生主动免疫。

4 结论与讨论

本试验结果表明，使用抗新城疫、禽流感（H5、H7、H9）多价二联卵黄抗体对ND和AI的预防保护率达到95%以上，发病初期治愈率可达到95%以上，发病中期治愈率80%～90%之间，晚期效果不理想，说明越早应用抗体效果越好。本研究通过饮水或拌料方式使用IgY防治ND、AI效果理想，即节省人力，又减少注射和抓鸡造成的应激反应。IgY与一般哺乳动物IgG相比，IgY具有较强的耐热、耐酸、抗离子强度和一定的抗酶降解能力[1]，IgY对消化酶具有一定的抵抗作用，因此适合在饲料和饮水中添加使用[2]。抗体具有中和相应病原体的特性，适时给机体输入抗体，可使易感动物的病毒感染呈现预防乃至治疗作用[3]。进入肠道的IgY可直接中和鸡新城疫病毒和禽流感病毒，使病毒不能黏附和进入肠道黏膜上皮细胞，导致病毒不能大量复制，起到预防作用。抗体也能透过毛细血管壁，分布于细胞外液和血流中，可中和体内细胞外液病毒，起到治疗作用，有研究表明：IgY在肠道消化酶作用下，降解为Fab和F c片段，可变小Fab部分很容易被肠道吸收，进入机体后能与相应的病原菌黏附因子结合，使病原菌不能黏附易感细胞而失去致病性，而IgY的稳定区F c部留在肠内[4]。但是IgY应用属于被动免疫，见效快，无任何毒副作用，缺点是维持时间短，因此，临床IgY多用于治疗或者紧急预防接种，鸡群仍然需要疫苗免疫，一般是使用抗体7 d后再用疫苗人工主动免疫[5]。

由于食品安全、耐药性问题，“无抗日粮、减抗养殖”是养殖业必然发展趋势，目前欧盟及我国已禁在饲料中添加抗生素，利用非药物添加剂替代抗生素已成为必然趋势[6-7]。IgY因具有零副作用、低成本、耐热性和较高的抵抗力，加之采集方便以及不受地域 限制等优点，在动物疫病的预防和治疗的过程中必将发挥重要的功效，具有非常大的使用价值。