非酒精性脂肪性肝病的肝脏芯片模型

金倩 范建高

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是遗传易感和胰岛素抵抗引起的代谢功能障碍相关脂肪性肝病，肝脏特征性病变包括大泡性肝脂肪变、小叶内炎症、肝细胞气球样变以及肝纤维化。随着肥胖、2型糖尿病和代谢综合征的流行，NAFLD已成为全球最常见的慢性肝病，其与肝硬化、肝癌和肝衰竭密切相关[1]。由于NAFLD患者的病理生理机制复杂，涉及肝脏各种类型的细胞与环境及基质效应的相互作用，至今尚缺乏肝细胞脂肪变、脂肪性肝炎和肝纤维化的理想模型。目前广泛使用的模式动物实验的主要局限性包括造模时间长、人与动物之间的遗传学差异、存在实验动物的伦理问题，以及缺乏人类NAFLD的典型疾病特征[2]。为此，近年来肝病的体外模型特别是肝脏芯片模型已用于NAFLD发病机制及新药研发研究，相关进展迅速。

一、肝病的体外模型

肝脏体外平面模型不能复刻人体肝脏诸多复杂结构，尤其是参与肝纤维化形成的细胞-细胞的相互作用。使用原代人肝脏细胞培养可以有效解决这一问题，但是由于存在异质性，该方式的可及性和可重复性有限[3]。现有的体外模型包括三维(3D)肝球体和生物打印3D模型，但这些模型是静态的，缺乏多细胞的相互作用、适当的功能重现、可提高模型相关性的原位生物分析能力和动态线索[4]。为了加强NAFLD的病因及机制研究以及更高通量的药物筛选以减少肝脂肪变性及其相关炎症或纤维化反应，亟需建立可重复且精确的仿生体外模型。理想的仿生体外模型需要满足以下几点：可复制肝脏的复杂结构及相关细胞的代谢功能、合理的模型生理设计参数、非特异性吸收和药物清除、通过相似的机制和试验终点模拟体内对损伤的反应[5]。

肝细胞的二维(2D)培养长期用于疾病模型和药物开发，是最简单的体外肝细胞培养方法，包括肝星状细胞的平面单培养、悬浮培养等。在个体发育过程中，多种发育信号精确调控，分化产生功能各异的细胞，并长期稳定地维持其生理功能。然而，功能细胞一旦离开体内微环境便会迅速去分化并失去功能。鉴于2D培养无法复制肝小叶内动态理化信号和微环境结构等自然特征，2D时肝细胞功能通常会迅速丧失，2D研究不适用于肝脏长期研究试验，并且研究结果不能简单类推到人体。当然在某些特殊情况下，微模式共培养物可数周保持稳定并保留某些肝脏特有的功能[3]。但是，这些模型通常在体内的基因表达和代谢活性的复制能力有限。

另一种肝脏疾病的体外模型是肝球体，重建类似于天然结构和功能的3D肝组织，包括肝细胞脂肪堆积和胶原沉积。然而，它们通常是静态的，并且在多个细胞类型的架构和结合方面受到限制。为了改进这一点，研究人员利用人体细胞开发了3D模型，包括微流控、微生理平台，称为“肝脏芯片”模型[6-7]。

二、肝脏芯片模型

肝脏芯片是一个3D体外肝脏微生理系统，一个微观模拟肝细胞状态和肝脏动态理化环境的高通量系统将非实质细胞(NPC)整合于由人脐静脉内皮细胞和组织巨噬细胞、库普弗细胞组成的血管层以及由肝星状细胞和肝实质细胞组成的肝细胞层，二者通过在灌注通道的入口和出口处添加发光传感器，实时测量耗氧量[8]。肝脏芯片中的细胞表现出明显的分化和结构重组，包括极化，但其功能仅稳定4 d。另一个巧妙的设计是多尺度结构层次，从而使需要长期培养以观测药物清除以及区域性生理学研究成为可能[9]。然而，由于缺乏对正常肝脏生理至关重要的NPCs，该模型不能充分反映肝细胞功能和极化的生理调节。超大肝小叶(VLSLL)芯片模型由一个六角形组织培养室的集成网络和一个单独的种子饲喂网络组成，模拟了肝小叶与中央静脉的基础结构[10]。VLSLL芯片拥有胆小管网络，通过微流控内皮样屏障创建生物激发的人工肝窦系统。上述两种模型通过模拟内皮层的扩散通道限制肝细胞通过，并保护肝细胞免受压力，同时允许营养物质的扩散。然而，这些非生物内皮样屏障不存在于人体，无法在体内重现验证细胞-细胞相互作用和药物代谢。

另一种通过恒定灌注以维持3D组织培养的装置，将多个流体隔离的生物反应器以多孔板的形式集合成一个阵列，每个生物反应器包含一个支架介质，从而形成数以百计的3D微型组织单元[11]，并与连续的介质循环共同培养的肝细胞和肝窦内皮细胞形成功能性肝样组织。与静态多孔板类似，该系统中的生物反应器是流体隔离的，不能结合两个或多个单独的组织培养孔。

三、NAFLD的肝脏芯片模型

油酸(OA)和棕榈酸(PA)等游离脂肪酸(FFA)可用于诱导原代大鼠肝细胞脂肪变性，其中PA导致剂量依赖性细胞毒性效应与活性氧(ROS)增加和白蛋白生成减少相关。NAFLD芯片设计一个包含人肝癌细胞株(HepG2细胞)的中央腔室，该腔室被紧密间隔的平行微通道包围，以模拟内皮细胞。为了使剪切应力最小，介质流经一个通过微通道连接到中央腔室的单独腔室。实验中，向培养物中添加OA和PA，48 h就可诱导NAFLD，可通过细胞内甘油三酯积聚、细胞活力和细胞内活性氧水平的测定[12]来揭示发病机制。

与单细胞培养相比，肝脏芯片模型具有复杂的细胞外基质和胆管、紧密连接、桥粒、脂质储存等肝结构，并进一步改善了细胞色素P450(CYP)功能和表达。在另一个基于FFA的NAFLD模型中，使用12个带有内置泵的生物反应器控制产生氧梯度的介质的流量来模拟体内条件[13]。装置使用原代人肝细胞，向培养基中添加OA和PA共14 d，细胞内出现甘油三酯积聚、CYP2E1和CYP7A1等关键基因上调，并出现炎症相关蛋白及肝损伤和纤维化。该模型通过显示肝细胞甘油三酯含量减少，可用于筛选吡格列酮、二甲双胍等治疗脂肪肝的药物。虽然肝细胞在高浓度的FFA作用下，通过降低CYP3A4等代谢酶活性以及表达多种脂肪因子，从而可以出现脂肪性肝损害。由于缺乏NPC，这种模型仍然缺乏NAFLD的一些特征性改变。

为了研究肝脏与其他器官的相互作用以及药物动态反应，目前已研发成功将不同器官连接在芯片上的多器官平台。例如，装置由肠侧胶原支架多孔膜隔开的两个腔室组成，Caco-2细胞植入肠腔，HepG2细胞植入肝腔[14]。无血清培养基灌流24 h后，再用含OA和PA的培养基灌流细胞24 h，然后对α-脂肪酸(ALA)、丁酸盐和肿瘤坏死因子(TNF)-α干预后的肝脂肪变进行定量。结果发现，ALA降低了芯片和2D培养物中甘油三酯积聚；丁酸盐通过增强肠屏障功能和减少肝细胞内脂质积聚可减轻肝脂肪变性；肿瘤坏死因子-α则通过影响肠道诱发肝脂肪变性，在2D单层培养中则没有这种现象。

综上所述，体外肝细胞培养经历了从经典单层培养模式到先进的肝脏器官模型的转变，可更精确地从时间和空间上控制细胞-细胞和细胞-基质间相互作用。目前各个商业公司已开发了多种用于研究肝病进展、促进药物研发及药物毒性试验的肝脏芯片模型，分别适用于不同研究目的的肝脏疾病相关试验，满足客户的个性化需求[4]。然而，生物工程技术仍然处于初级起步阶段，还需要更多的研究工作来开发代表性模型用于研究肝脂肪变及其相关肝炎肝纤维化的发机制和新药研发。未来的发展方向可能集中在包含肝脏所有细胞类型的设备开发上。此外，对于肝脏模型研究进行实时监测而不是终点分析,将更好地了解这些设备中的动态变化，以便深入探讨疾病相关演变过程和发生机制。随着技术的不断改进和完善，肝脏芯片技术有望在基础生物学研究、制药业和临床肝脏病学领域有十分广阔的应用前景。