Toll样受体与类风湿性关节炎的相关性及靶向防治的研究进展▲

2020-03-03周凡琦运晨霞

广西医学 2020年11期

周凡琦冷静运晨霞,3

(1 广西中医药大学基础医学院，南宁市 530200，电子邮箱：1468749694@qq.com；2 广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室，南宁市 530200；3 广西医科大学研究生院，南宁市 530010)

【提要】类风湿性关节炎(RA)是一种常见的慢性自身免疫性疾病，可导致关节肿胀、疼痛、活动障碍等。阐明RA的发病原因及发病机制，对于RA的诊治尤为重要。研究表明，Toll样受体在RA患者关节周围的免疫细胞及滑膜细胞中的表达均有所改变，参与了RA的发生和发展，在RA的发病进程中扮演着重要作用。本文就Toll样受体的表达模式、识别配体及其与RA的相关性，以及Toll样受体靶向药物在RA中的应用作一综述，为进一步了解RA的发病机制提供参考。

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是较为常见的慢性自身免疫性疾病，病因多样。RA的主要特征是手与脚的小关节呈向心性对称发病，老年患者可能会波及远端大关节，病程长者往往出现关节畸形，更为严重者可导致功能丧失[1]。但目前RA的发病机制尚未完全清楚。Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是一种天然免疫识别受体，在先天性和适应性免疫反应中均起重要作用。TLR除了识别特定的病原相关分子模式外，还可以识别机体内部产生的损伤相关分子模式，而激活TLR信号通路可导致各种炎症性因子表达升高。研究表明，TLR的异常表达、外源性或内源性配体对TLR通路的不当触发可能导致自身免疫性反应和组织损伤[1-2]。因此，本文就TLR的表达模式、识别配体及其与RA的相关性，以及TLR靶向药物在RA中的应用进行综述，为进一步了解RA的发病机制及防治提供参考。

1 TLR的表达模式、识别配体及其与RA的相关性

TLR是Medzhitov等[3]从哺乳动物体内发现有与果蝇体内相似的Toll蛋白分子后命名的。随着对TLR的不断研究，学者们先后从人体中发现了10种TLR，分别是TLR1～10。其中，TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR10主要表达于细胞质膜表面，识别微生物的脂质、脂蛋白和蛋白质等；而其他TLR主要在细胞核内表达，识别微生物的核酸[4]。正常情况下，TLR主要表达在多种免疫细胞，如单核细胞/巨噬细胞、粒细胞、淋巴细胞、树突状细胞等[2]；而在疾病状态下，TLR也表达在相应病变部位的内皮细胞或成纤维细胞上，介导炎症反应。

1.1 TLR1 TLR1主要表达在淋巴细胞、单核-巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞及中性粒细胞等细胞表面，通常和TLR2形成异源二聚体，主要识别三乙酰化脂肽及肽聚糖[5-6]，常与TLR2一起参与对微生物制剂的先天免疫反应。而在RA患者体内，TLR1也表达在RA患者关节的滑膜成纤维细胞、角化细胞和内皮细胞的细胞膜上[7]，但具体机制尚无文献报告，推测TLR1同TLR2一起受外源性配体的刺激直接或间接引起了T细胞和B细胞的激活，从而参与RA的发生。

1.2 TLR2 TLR2主要表达在小胶质细胞、单核-巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、B细胞和T细胞表面，常与TLR1或TLR6配对形成异二聚体的形式[5]，主要识别外源性的革兰阳性菌的肽聚糖、胞壁酸以及非典型的脂多糖，也识别分枝杆菌的脂蛋白、锥形虫的糖肌醇磷脂、真菌的酵母多糖，以及宿主体内产生的损伤相关分子模式(如热休克蛋白等)[8]。临床研究表明，TLR2可高度表达在与RA相关的滑膜组织系的巨噬细胞和成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte,FLS)，以及RA患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)上，并且TLR2信号通路的活化可明显诱导FLS的迁移和其对关节的侵袭，并促使细胞释放基质金属蛋白酶而引起关节的炎症[8-9]。TLR2与其配体结合后，还可使RA患者FLS以及PBMC释放白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-17等炎症因子，导致关节软骨炎症和退化[10]。动物实验研究表明，在大鼠或小鼠的关节内注射TLR2配体(如链球菌细胞壁片段)可诱导髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)依赖性的炎症和关节炎发生，此外，增加TLR2的表达也可以增强胶原蛋白诱导的RA[11]。这均表明细胞表面TLR2表达增加，或者受配体刺激后信号通路的活化，均可诱导炎症因子的释放，从而参与RA的发病过程。

1.3 TLR3 与其他TLR的表达模式不同，TLR3在胎盘和胰腺中表达最丰富，但仅限于表达在树突状细胞亚群上；而在其他组织中TLR3也可以表达在T细胞、自然杀伤细胞、粒细胞和单核细胞上[12-14]。TLR3主要识别的配体为病毒的双链RNA以及坏死细胞释放的内源性配体双链RNA[15]。TLR3的信号通路与其他TLR不同，只有非依赖MyD88途径，其使用β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR-domain-containing adaptor-inducing interferon-β,TRIF)作为唯一适配器，最终通过干扰素调节因子3和核因子κB信号通路的活化，诱导Ⅰ型干扰素的产生，在抗病毒感染中发挥重要作用[16]。

临床研究显示，RA患者在患病早期滑膜组织及关节的FLS上TLR3表达水平升高，这可能与RA患者滑膜中存在肠道菌群释放的DNA和肽聚糖有关，这些成分的存在可导致TLR3的活化[17-18]。同时在RA患者关节中，坏死细胞释放的内源性RNA也可作为配体激活TLR3信号通路，而活化的TLR3通路诱发产生肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、IL-1、IL-6、IL-17等炎症因子，又能增加FLS中TLR3的表达，从而加重关节炎症[19]。动物实验研究表明，微小RNA-26a可抑制TLR3的表达，通过抑制TLR3信号通路的活化，使降植烷诱导的关节炎大鼠的症状得到缓解，目前微小RNA-26a已经成为与TLR信号传导相关的炎症性疾病的药物治疗靶点[20]。以上研究结表明，TLR3在RA发生、发展中均具有重要作用，而抑制TLR3信号通路可抑制关节的炎症反应。

1.4 TLR4 TLR4主要表达在树突状细胞、单核-巨噬细胞、中性粒细胞等免疫细胞及各组织器官的上皮细胞表面[21]。TRL4除了能识别外源性病原相关分子模式，如革兰阴性菌的LPS、呼吸道合胞病毒F蛋白、透明质酸寡糖外，也可以识别宿主细胞内的损伤病原相关分子模式，如热休克蛋白60/70、硫酸肝素蛋白多糖成分以及纤粘连蛋白和纤维蛋白原[22]。临床研究结果显示，TLR4与RA的发病密切相关，在RA患者的PBMC以及滑膜组织/滑液中抗原呈递细胞表面的TLR4表达水平均升高；TLR4受配体刺激后可产生大量的细胞因子，启动机体的炎症反应最终导致关节组织和骨组织的破坏[23-25]。体外研究也表明RA滑膜细胞或巨噬细胞受到脂多糖刺激后，TLR4相关信号通路即核因子κB、丝裂原活化蛋白激酶等炎症信号通路活化，从而导致炎症因子大量释放，引起关节滑膜的炎症；而抑制TLR4信号通路可有效抑制TNF-α、IL-1、IL-6的分泌[26]。此外，在TLR4基因缺乏的小鼠中，Ⅱ型胶原蛋白诱导的关节炎的发病率低，关节炎的严重程度降低[27]。由此可见，TLR4在RA的发生发展中也发挥了重要作用。

1.5 TLR5 TLR5主要表达在髓源性细胞，如单核-巨噬细胞，其识别的配体主要是细菌鞭毛，以及RA患者关节FLS产生的内源性配体[28-29]。研究表明，来源于RA患者单核-巨噬细胞和滑膜组织上皮细胞的TLR5表达比健康对照组更高[27]。研究发现，TLR5不仅调节RA单核细胞中的TNF-α的表达，而且TLR5的表达水平与TNF-α的产生以及RA疾病的严重程度评分密切相关[26]。因此，有效靶向调控TLR5有可能降低TNF-α的表达并降低RA严重程度。

1.6 TLR6 TLR6主要表达在小胶质细胞、单核-巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、B细胞和T细胞等表面，易与TLR2形成异源二聚体，其识别与TLR2相同的外源性配体，如革兰阳性菌的胞壁酸、真菌的酵母多糖及支原体的二脂酰脂肽和一部分TLR2的内源性受体[30]。尽管TLR1、TLR2和TLR6有相同的表达模式，但在B细胞表面TLR1和TLR6比TLR2表达的更多[31]，但是目前尚未发现TLR6在RA中的作用。

1.7 TLR7与TLR8 TLR7与TLR8的作用极其相似，但表达部位不同。TLR7主要是表达在抗原提呈细胞，包括单核-巨噬细胞、树突状细胞及B细胞表面；而TLR8主要表达在髓系细胞上，如单核细胞、巨噬细胞和髓系树突状细胞[32-33]。TLR7和TLR8识别的配体主要以病毒单链RNA为主，也可识别咪唑喹啉化合物。研究表明，TLR7和TLR8都可表达于RA滑膜组织内膜、滑膜巨噬细胞以及FLS表面，并且经炎症因子IL-17和IL-8刺激后TLR7的表达水平可增加，而经脂多糖LPS和IL-1刺激后TLR8的表达水平亦可增加，从而加重RA的炎症反应[34]。动物实验研究表明，建立胶原诱导的RA小鼠模型后，体内TLR7遗传缺失小鼠的关节炎症明显轻于TLR7表达正常的小鼠[35]。这些研究均揭示了TLR7和TLR8在RA发病过程中的潜在作用。

1.8 TLR9 TLR9主要表达在浆细胞样树突状细胞、记忆性B淋巴细胞等免疫细胞及肠上皮细胞、肺泡上皮细胞和角质形成细胞非免疫细胞的胞内内膜上[36]。其主要识别细菌或病毒非甲基化的脱氧胞苷酸磷酸盐-脱氧鸟苷酸DNA。研究表明，通过抑制RA模型鼠TLR9的表达可以缓解RA疾病的严重程度，这表明过度表达的TLR9可以导致RA的疾病进展[37]。

1.9 TLR10 TLR10只表达在人而不表达在啮齿类动物的免疫细胞上，以B细胞表达最多[38]。TLR10可以与TLR2形成异源二聚体，因此可以对TLR2识别的配体产生反应[39-40]，但是对于TLR10本身的配体和功能目前尚未进一步研究[41]。

2 TLR靶向药物在RA中的应用

鉴于TLR在RA中的作用，很多TLR的拮抗剂正在被研发或已用于RA的临床治疗。

2.1 OPN-305和OPN-301 两者是人源化的单克隆抗体，是TLR2的拮抗剂，能够阻断TLR2/1和TLR2/6介导的信号转导。研究表明， OPN-305和OPN-301可阻断体外培养的RA滑膜组织中 TLR2信号通路，可以有效抑制RA患者体外培养物分泌炎症因子，并能抑制 RA 滑膜成纤维细胞的迁移和侵袭[42]。这为临床防治RA提供了治疗基础。

2.2 NI-0101 NI-0101是阻断TLR4的第一代人源性单克隆抗体，可与TLR4的配体决定部位结合，干扰TLR4二聚化，从而抑制TLR4通路的活化。目前用于急慢性炎症、自身免疫疾病的临床前研究[43]。此外，NI-0101目前正在开发用于RA的治疗，具有个体化用药的潜力[44]。

2.3 CU-CPT8m分子和CPG-52364 CU-CPT8m分子可抑制TLR8的活性，而对其他TLR几乎没有任何影响；复合抑制剂CPG-52364是选择性TLR7/8/9拮抗剂，目前这两者还处于临床前研究。研究表明，CU-CPT8m可以有效地降低骨关节炎患者滑膜细胞产生IL-1β、TNF-α等炎症因子的水平，这表明作为TLR8抑制剂，CU-CPT8m分子具有成为抗炎药物的潜力[45]。动物实验显示，复合抑制剂CPG-52364对系统性红斑狼疮等自身免疫疾病具有抑制作用，目前正在进行一期临床实验[46]。因此，CU-CPT8m分子、复合抑制剂CPG-52364有望成为靶向治疗RA的潜力药物。

2.4 羟基氯喹羟基氯喹是TLR7/9的抑制剂，临床上广泛用于治疗疟疾和RA。羟基氯喹可显著抑制CpG诱导的IL-6和TNF-α分泌，其机制是通过抑制TLR9介导的B细胞功能；同时其也能拮抗TLR7和TLR8[47]。研究表明，羟基氯喹联合中药独活寄生汤或甲氨蝶呤治疗可明显降低 RA患者体内的炎性因子水平，能够显著缓解 RA 病情，改善关节活动[48-49]。

2.5 CpG-c41分子动物实验表明，CpG-c41分子可通过竞争性结合TLR9受体阻断其诱发的炎症反应，同时还能交叉干扰脂多糖诱发的TLR4信号通路，抑制IL-6的分泌[50]，可为未来临床RA的防治提供治疗基础。