维生素D及其受体与子宫内膜癌的相关研究进展

刘思思，孙振杰，冯 文

子宫内膜癌是发达国家女性生殖道最常见的肿瘤，是美国女性四大癌症之一。据统计，2018年欧美国家新增子宫内膜癌病例63 230例，其中90%以上患者的发病年龄在50岁以上[1]。子宫内膜癌的治疗主要包括手术、放疗、化疗和内分泌治疗。由于目前临床上患者对化疗的不良反应大且易耐药，因此寻找高效低毒的药物成为临床研究的当务之急[2]。维生素D是人体的必需脂溶性维生素之一，除维持钙磷代谢平衡，在抗肿瘤增殖、免疫调节方面也有重要作用。有研究证明，在卵巢癌、子宫内膜癌和宫颈癌中已检测到维生素D受体（vitamin D receptors，VDR）的存在。随着对维生素D抗肿瘤机制的深入研究，其有望成为子宫内膜癌内分泌治疗的新兴药物。

1 维生素D及VDR的生物学基础

1.1 维生素D代谢途径维生素D家族主要包括植物来源的维生素D2（麦角钙化醇）和动物来源的维生素D3（胆钙化醇）。来自饮食或皮肤的维生素D通过血液循环与维生素D结合蛋白（VDBP）结合，首先被输送到肝脏。在肝脏中，维生素D被25羟化酶代谢为骨化二醇[25（OH）D]，这是血清中维生素D的主要循环形式。骨化二醇在肾脏经过1α-羟化酶进一步代谢为骨化三醇[1α，25（OH）2D3][3]。骨化三醇作为主要的代谢活性形式进入循环，与VDBP结合后作用于靶组织，调节钙磷代谢，并对细胞增殖分化及免疫系统产生生物学作用[4]。

1.2 VDR的生物学作用VDR作为维生素D发挥作用的受体，存在于细胞核内，来源于类固醇激素/甲状腺激素受体超家族，主要通过基因组和非基因组途径起作用[5]。VDR存在于30多种组织中，常见于肠、肾、骨、卵巢、乳腺和前列腺等。VDR有两个核心功能域，一个是高度转换DNA结合域（DBD），其在氨基（NH2-）末端含有两个锌键；另一个是可变配体结合结构域（LBD），其在羧基（COOH-）末端含有至少12个α-螺旋和3个β-折叠。骨化三醇与VDR结合能调节下游靶标的基因组和非基因组。在基因组途径中，骨化三醇通过结合细胞溶质型VDR，促进VDR磷酸化与类视黄醇受体（RXR）的异二聚化，实现复合物核转位。骨化三醇-VDR-RXR复合物与维生素D反应元件（VDRE）结合，募集转录共激活因子或共抑制因子调节靶基因的mRNA表达，以调节钙磷代谢等功能[6]。最新研究表明，自噬衔接蛋白p62/SQSTM1在异二聚化和募集过程中起关键作用[7]。骨化三醇-VDR-RXR复合物能直接结合肝星状细胞中的VDR和RXR靶向基因发生自噬。在非基因组途径中，骨化三醇与膜结合型VDR结合，通过细胞内信号分子相互作用诱导细胞信号通路发生变化。有研究发现细胞色素P450蛋白（CYP11A1）作为新型维生素D代谢酶，其代谢物可增强紫外线诱导的DNA损伤和氧化应激的防御机制，以细胞依赖性方式发挥抗癌作用。而CYP11A1的产物，如20（OH）D和20，23（OH）D，已被证明可作为VDR的偏向激动剂[8]。因此，维生素D不仅能通过骨化三醇-VDR途径抑制肿瘤细胞增殖，也能通过CYP11A1衍生物的VDR或甲状腺激素样受体（RORα/γ）途径发挥抗肿瘤作用。

2 维生素D抗肿瘤作用及其机制

大量研究表明，维生素D参与调节肿瘤发生的整个过程[9]，其机制包括调节细胞行为，如增殖、分化、细胞凋亡、自噬和上皮间质转化（EMT），以及调节细胞-微环境相互作用，如血管生成、抗氧化剂、炎症和免疫系统。

2.1 维生素D在抗炎、DNA损伤修复和抗氧化防御中的作用炎症是癌症发展的危险因素之一。有研究表明，使用过抗生素的患者子宫内膜癌的发病率会降低。近来针对子宫内膜癌的研究发现，维生素D对参与炎症和先天免疫应答的核因子κB（NF-κB）具有诱导抑制作用，能降低趋化因子CXCL1和CXCL2的表达，抑制肿瘤转移浸润[10]。维生素D可打破免疫细胞和癌细胞间的平衡，进而减少促炎细胞因子的产生[11]。人体每日补充维生素D可减少氧化性DNA损伤，表明维生素D能保护人体免受氧化应激诱导的DNA损伤[12]。研究发现，核转录因子E2相关因子2（NRF2）作为受维生素D调节的转录因子，能增加抗氧化酶表达，提示维生素D可能是诱导抗氧化酶并发挥抗氧化防御的潜在因素[13]。

2.2 维生素D在细胞增殖和分化中的作用骨化三醇在正常细胞和癌细胞中均有抑制细胞增殖和分化的作用。CYP11A1的新型代谢产物通过与VDR结合抑制细胞增殖，诱导细胞分化，发挥降低血钙的作用[14]。维生素D通过调节生长因子、细胞周期和信号传导途径介导抗增殖作用。维生素D能增加胰岛素样生长因子3（IGF-3）和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制剂p21和p27蛋白的表达，抑制CDK2表达，进而抑制IGF-1和IGF-2刺激的细胞增殖和细胞周期进展[15]。维生素D诱导分化与其相关的抗增殖特性，调节多种细胞内信号通路，如磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、NF-κB 和 Ca2+信号传导。

2.3 维生素D在细胞凋亡、自噬及端粒酶活性中的作用诱导癌细胞凋亡可抑制肿瘤发展。研究表明，维生素D能在子宫内膜癌细胞中诱导程序性细胞死亡，从而激活内在细胞凋亡途径半胱氨酸天冬氨酸酶3（Caspase-3）和Caspase-9，并破坏促凋亡因子和抗凋亡因子之间的平衡，实现抑制细胞凋亡的过程[16]。

自噬是在细胞存活和凋亡中起关键作用的分解代谢过程。研究表明，维生素D可引起细胞毒性或细胞抑制性自噬，维生素D诱导的自噬细胞死亡主要通过上调自噬相关基因Beclin1实现[7]。维生素D介导的自噬细胞死亡中有CDK抑制剂的参与，主要受p19或p27蛋白表达缺失调节实现。维生素D还可通过促进DNA损伤诱导转录因子4（DDIT4）的表达诱导自噬。

激活端粒酶可使肿瘤细胞端粒长度不因细胞分裂次数的增加而缩短，从而赋予肿瘤细胞无限分裂能力。研究显示，维生素D可通过减少人端粒酶逆转录酶（hTERT）mRNA生成而降低mRNA的稳定性，从而降低端粒酶活性，诱导癌细胞凋亡[17]。Kasiappan等[18]研究显示维生素D能抑制肿瘤组织中端粒酶的过表达，从而降低肿瘤细胞存活率和增殖速率。在子宫内膜癌的Ishikawa细胞中，骨化三醇诱导成熟微小RNA-498（miR-498）水平升高，促进 hTERT mRNA降解，阻止miR-498转录基因所调控的细胞存活。

2.4 维生素D在肿瘤转移、侵袭及血管生成中的作用EMT、转移侵袭和血管生成是肿瘤发生和进展的基本过程。维生素D可降低纤溶酶原激活系统中某些因子和基质金属蛋白酶（MMP）的表达，并抑制其活性，减少肿瘤细胞浸润所需的蛋白水解酶的生成。维生素D可通过降低肿瘤细胞层黏连蛋白受体和整合素的表达削弱肿瘤侵袭性[19]。研究发现参与子宫内膜癌细胞分化过程的E-钙黏蛋白和乳铁蛋白等基因上调依赖于ICB-1基因，ICB-1基因的缺失阻断了维生素D对上皮细胞EMT的抑制[20]。研究发现SEMA蛋白家族的SEMA3B和SEMA3F在子宫内膜癌细胞中受骨化三醇诱导，表达呈现较低水平，随着肿瘤进展，SEMA蛋白表达进一步降低，表明SEMA蛋白在抑制癌基因的转化过程中起关键作用。有研究显示，使用骨化三醇处理Ishikawa细胞株，可下调参与肌动蛋白结构重组的蛋白质表达和活性，诱导肌动蛋白丝解聚，进而影响细胞骨架重组。维生素D能调节肿瘤细胞侵袭性，Bokhari等[21]发现经维生素D处理过的子宫内膜癌HEC-1B细胞和Ishikawa细胞的肿瘤侵袭能力减弱，同时这两种细胞表达的侵袭分子标志物（MMP-2和MMP-9）水平也会降低。

3 维生素D与子宫内膜癌

关于维生素D与子宫内膜癌发病风险的相关性，国内外已有相关研究报道。Tagliabue等[22]的研究发现，编码VDR基因（rs7041和rx4588）的基因多态性与不同部位的肿瘤无关。而在动物研究却发现摄入维生素D可降低肥胖引起的子宫内膜癌的发病率。随后有关研究发现，骨化三醇浓度会随着体质量指数的增加而降低，推测骨化三醇的升高可能不是引起成年女性肥胖的重要激素机制[23]。之后Yabushita等[24]在人子宫内膜癌RL95-2细胞和Ishikawa细胞中通过免疫组织化学（免疫组化）法发现VDR蛋白表达和核定位现象。随后Agic等[25]通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）发现，子宫内膜癌细胞核内VDR蛋白及mRNA表达水平高于正常内膜细胞核内表达水平，提示子宫内膜癌细胞可能是维生素D作用的靶细胞。通过蛋白质印迹法发现，24-羟化酶蛋白水平在子宫内膜癌细胞中表达水平高于正常子宫内膜细胞，此现象可能与肿瘤进展程度有关。而24-羟化酶mRNA水平升高与不同组织类型肿瘤的预后有关。24-羟化酶主要负责的维生素D分解代谢，降低24-羟化酶浓度可能有利于维生素D抗癌治疗。Bergadà等[26]同样证实了子宫内膜癌组织中24-羟化酶蛋白水平低于正常子宫内膜；但与肿瘤的不同病理分期无关。近年来，An等[27]收集60例子宫内膜癌患者肿瘤组织进行免疫组化检测，发现VDR在细胞质和细胞核中均有表达，而在细胞质中的表达率更高，VDR从细胞核转移到细胞质表达与子宫内膜癌组织学分级低有关，可能子宫内膜癌组织细胞质与VDR间某种共同途径被激活，使VDR在细胞质表达。总之，以上所提出的分子学证据展现维生素D代谢酶及VDR表达的变化，提示维生素D可能作为子宫内膜癌治疗方法的潜在靶标。

大量的实验室研究发现骨化三醇可抑制子宫内膜癌细胞的增殖转移速率。Saunders等[28]针对子宫内膜癌RL95-2细胞株进行实验发现，单独使用细胞毒性药物卡铂，其可呈浓度依赖方式抑制癌细胞生长，最大抑制率可达78%；单独使用骨化三醇以相同方式抑制癌细胞生长，最大抑制率可达29%；卡铂联合骨化三醇共同加入RL95-2细胞株可大幅度提高细胞生长抑制率。但此实验未从VDR分子机制角度阐明现象。随后Yabushita等[24]研究发现，50 nmol/L骨化三醇呈剂量依赖性抑制RL95-2细胞生长，抑制率达44%；6 d后，RL95-2细胞高水平表达细胞角蛋白多肽，在胶原凝胶中培养时变成具有明显极性的柱状并形成腺样结构。Lee等[29]研究发现骨化三醇与雌激素联合使用促进子宫内膜癌细胞凋亡和细胞周期阻滞，显现了抗肿瘤作用，发现这两种药物均可通过Caspase-3激活增强VDR的表达并抑制细胞增殖。近年来Kuittinen等[30]研究发现，单独使用紫杉醇与紫杉醇联合卡铂使用同样有效，且比单独使用卡铂更有效地抑制子宫内膜癌细胞的生长。而骨化三醇与紫杉醇联合卡铂使用能进一步抑制子宫内膜癌细胞的生长。紫杉醇针对子宫内膜癌UT-EC-1细胞系杀灭率高达25%，而紫杉醇在UT-EC-3细胞系中的杀灭率高于卡铂，达53%。紫杉醇联合骨化三醇较单一使用紫杉醇对子宫内膜癌细胞具有更强的生长抑制作用。并且在VDR高表达的UT-EC-1细胞系中观察到了卡铂和骨化三醇的协同抗肿瘤作用。

林兰等[31]在体外实验中发现，经不同浓度骨化三醇作用于子宫内膜癌HEC-1-A细胞不同天数后，各组细胞生长增殖均受到明显抑制，且随着骨化三醇作用浓度增加，细胞增殖能力呈现下降趋势，可能是通过下调Skp2基因转录水平及增加P27蛋白结构稳定性，减少其降解。研究显示，大多肿瘤发生、发展及预后受负性调控因子Skp2/P27影响。子宫内膜癌中检测到Skp2表达上调，导致P27蛋白表达减少，预示着Skp2/P27与子宫内膜癌的发生发展、侵袭转移有关。林颢等[32]选择Skp2基因作为RNA干扰（RNAi）慢病毒靶基因，构建特异表达载体转染子宫内膜癌HEC-1-A细胞，发现重组慢病毒RNAi在蛋白质和mRNA水平上均可有效抑制Skp2基因表达，干扰细胞增殖分化，下调Skp2基因表达，上调P27蛋白表达，却并未影响P27 mRNA水平。因此可推测，RNAi阻断Skp2基因主要通过减少P27蛋白的泛素化降解，从而上调P27蛋白表达。

4 新型非高血钙维生素D衍生抗癌剂PT19c与子宫内膜癌

随着对抗肿瘤机制的深入发掘，维生素D及其类似物开始广泛应用于肿瘤内分泌治疗中，而高钙血症仍然是临床中使用维生素D的主要障碍。新合成类似物如EB1089和Maxacalcitol已被证实在各种实体瘤中具有降低血钙效应。有研究发现，新型非高血钙维生素D衍生的抗癌剂PT19c有较弱的VDR拮抗作用，因PT19c在VDR-配体结合结构域（VDR-LBD）中发生空间倒置，缺少与VDR结合，不发挥经典的骨化三醇-VDR-LBD作用[33]。研究人员用裸鼠卵巢癌SKOV-3细胞和子宫内膜癌ECC-1细胞衍生的异种移植物建模，评估PT19c的抗肿瘤功效，在卵巢癌细胞中发现PT19c治疗组降低了裸鼠异种移植肿瘤的进展，而子宫内膜癌细胞中使用骨化三醇作为对照组，在实验第20天时，PT19c治疗组的肿瘤体积明显减小。而骨化三醇组明显减缓子宫内膜癌发展，而在携带子宫内膜癌ECC-1细胞异种移植物组中肿瘤体积持续增加。最后发现，PT19c治疗可导致黏着斑形成和肌动蛋白丝功能障碍。肌动蛋白利用快速聚合和解聚以维持包括癌细胞在内的活细胞形态。当肌动蛋白聚合被阻断且现有肌动蛋白丝组装受到干扰，细胞将发生凋亡和死亡。有学者也观察到细胞松弛素可破坏细胞骨架，发生Caspase-3介导的细胞凋亡。这为通过抑制黏着斑形成和引发肌动蛋白突变治疗上皮性卵巢癌或子宫内膜癌提供了可行的治疗思路。

5 展望

目前研究已证实维生素D在肿瘤治疗和预防中发挥抗增殖、促分化和免疫调节作用。高钙血症限制了维生素D的需求量与最大安全剂量，影响其抗肿瘤作用的发挥，但由于大多实验结果源于流行病学分析和实验室研究，缺乏实际的临床工作应用，外加饮食摄入的维生素D含量及日照条件的不可控性，仅靠观察性研究总结维生素D对肿瘤作用的理论依据有待进一步证实。对维生素D及其类似物在子宫内膜癌中作用的分子机制的体内或离体研究较少；大多数研究是使用永生化子宫内膜癌细胞完成的。此外，VDR除调控转录水平，是否还可调控其他功能，尚无定论。深入研究维生素D及VDR在肿瘤发生、发展中的作用机制，将更好地提高人类对维生素D及VDR的认识水平，实现治疗肿瘤效益的最大化。