烟碱与苯甲酸的相互作用研究

邬帅帆，崔秀明，黄艳

华宝香精股份有限公司，上海市叶城路1299号 201821

烟碱是烟叶中含量最高的生物碱，不但大量以有机酸盐的形式存在于烟草植物中，在其他植物中也有发现。烟碱单体的易挥发性、易氧化性以及光分解的性质限制了其在新型烟草制品中的应用[1,2]。由于烟碱的分子结构是由两个氮杂环构成（图1a），其中吡啶环的氮原子由于芳香化的影响，碱性较弱，吡咯环的氮原子的碱性与脂肪族叔胺的碱性相近[3]，20℃ 8.1 g/L 浓度的烟碱水溶液的pH 值大约为10.2 左右，因此将烟碱与酸性化合物结合制备成复合物可以很好的解决上述的问题[4-6]。其中烟碱与苯甲酸的复合物应用最为广泛。苯甲酸是一种芳香族羧酸（图1b）又称安息香酸，是烟草制品许可使用的添加剂，其20℃饱和水溶液的pH 值大约为3 左右，因此可以和烟碱以盐的形式结合形成稳定的复合物，但是两者间的相互作用尚不明确。核磁共振氢谱法、红外光谱分析、等温滴定量热法、Job’s Plot 法以及化学理论计算，可以用来剖析烟碱与苯甲酸之间具体的相互作用方式[7,8]。

图1 （a）烟碱分子结构 （b）苯甲酸分子结构Fig. 1 (a) Molecular structure of nicotine (b) Molecular structure of benzoic acid

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

试剂：苯甲酸（分析纯）、氘代水（分析纯）购于国药集团化学试剂有限公司；烟碱（分析纯），购于百灵威科技有限公司。

仪 器： Bruker DRX - 400 核 磁 共 振 仪（ 瑞士Bruker 公司）； Nano-ITC 等温滴定量热仪（美国TA 仪器有限公司）； Gaussian 09 软件； Nicolet iS10 傅立叶变换红外光谱仪（美国Thermo Scientific 公司）； TGA 8000 型热重分析仪（美国PerkinElmer 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 Job’s Plot 法测定烟碱与苯甲酸的结合比例

配置0.02 mol/L 浓度的烟碱氘代水溶液以及0.02 mol/L 浓度的苯甲酸氘代水溶液，分别取适量溶液进行混合（见表1），使混合溶液中两者的摩尔比依次有所增减，但两者的摩尔浓度之和保持不变，测定所得混合溶液的核磁氢谱，记录烟碱甲基氢的核磁位移。

表1 Job’s Plot 法测定烟碱和苯甲酸的结合比例Tab. 1 Determination of the binding ratio by Job’s Plot method

1.2.2 红外光谱分析

烟碱、苯甲酸、烟碱苯甲酸复合物的红外光谱数据以空气为背景，采用KBr 压片法测量，测定的频率范围为4 000～600 cm-1。

1.2.3 等温滴定量热实验

25℃下，将20.3 mmol/L 的烟碱水溶液取50 μL置于注射器中，样池中加入170 μL 1.406 mmol/L 苯甲酸水溶液。用烟碱溶液滴定苯甲酸溶液，每次滴加3.98 μL，共13 次，每次间隔200 s。

1.2.4 分子建模计算

在Gaussian 09 软件中使用B3LYP/6-31G（d，p）方法完成所有的结构优化，频率、热力学性质和能量的计算。基组重叠误差BSSE 的计算是用Boys-Bernardi 的CP 方法。

1.2.5 热重分析

分别称取5 mg样品置于热重分析仪样品坩埚内，控制20℃/min 的升温速度，在空气氛围下从35℃升至400℃，测量样品的热重数据。

1.2.6 烟碱苯甲酸复合物的制备

称取16.2 g 烟碱于50 mL 三口茄形烧瓶，置于冰浴中搅拌15 min，称取12.2 g 苯甲酸分批少量加入烧瓶中，控制温度低于10℃，完成后撤除冰浴，继续于室温搅拌30 min，苯甲酸逐渐溶解，体系颜色加深呈深棕色。反应结束后，过滤取滤液即得烟碱苯甲酸复合物28 g，收率98.5%。

2 结果

2.1 烟碱与苯甲酸的结合比例

Job’s Plot 法是分析化学中用于确定两种物质结合量的一种化学计量方法，该方法以Paul Job 命名[9]。方法中保持两种物质总的摩尔浓度恒定不变，但两者的摩尔分数是变化的。以表1 中所得数据绘制Job’s Plot 曲线图，其中X 轴是苯甲酸的摩尔分数，即X=M苯甲酸/（M苯甲酸+M烟碱），Y 轴是烟碱甲基氢的摩尔化学位移量Y=Δδ×[M烟碱/（M苯甲酸+M烟碱）]，随着两者摩尔分数的此消彼涨，可得两条斜线，交汇点对应的X 轴数值即为混合物中苯甲酸的摩尔分数。由图2 可知，曲线最高点对应X 轴坐标为0.5，即苯甲酸的摩尔分数为0.5，故烟碱与苯甲酸的结合比例为1 : 1。

图2 用以测定结合比例的Job’s Plot 曲线图Fig. 2 the Job’s Plot for determination of binding ratio

2.2 烟碱与苯甲酸相互作用的核磁共振研究

按照烟碱与苯甲酸摩尔比1 : 1 制备烟碱苯甲酸复合物，取少量用氘代水溶解进行核磁氢谱检测。与烟碱的核磁氢谱比较可以发现（图3），复合物中烟碱的所有质子峰受苯甲酸的影响都向低场迁移，说明两者间存在明显的相互作用力。分别计算烟碱所有质子的核磁位移量（表2），发现吡咯环上质子的位移量明显大于吡啶环上质子的位移量，并且越靠近氮原子的质子的位移量越大，说明苯甲酸主要是与烟碱中的吡咯环相互作用，吡咯环氮原子周边的质子由于受到苯甲酸羧基吸电子效应的影响，化学位移向低场迁移较明显。

表2 烟碱质子氢核磁位移量Tab. 2 1H NMR chemical shifts of nicotine

图3 核磁氢谱中烟碱质子氢受苯甲酸作用发生化学位移（A：烟碱；B:烟碱苯甲酸1：1 复合物）Fig. 3 1H NMR chemical shifts of nicotine (A: nicotine; B: 1:1 nicotine-benzoic acid complex)

2.3 烟碱与苯甲酸相互作用的红外光谱研究

烟碱、苯甲酸以及烟碱苯甲酸复合物的红外光谱数据如图4 所示。苯甲酸中O-H 结构单元在2500～3300 cm-1范围内有一系列宽而散的伸缩振动吸收峰，在1420 cm-1及925 cm-1的吸收峰是O-H 面内弯曲振动和面外摇摆振动产生的。然而在相应的烟碱苯甲酸复合物中上述几个峰基本消失，说明复合物中不存在O-H 键，而是形成了羧酸负离子与吡咯季铵正离子间的离子键，进一步证明了烟碱与苯甲酸之间存在的相互作用力[10]。

2.4 烟碱与苯甲酸的结合常数

图4 烟碱、苯甲酸及烟碱苯甲酸复合物的红外光谱图Fig. 4 Infrared spectra of nicotine, benzoic acid, and nicotine- benzoic acid complex

图5 等温滴定量热法测定烟碱与苯甲酸的结合热力学数据及结合常数Fig. 5 Determination of thermodynamic data and association constant by ITC

采用等温滴定量热法（ITC）测定烟碱与苯甲酸的结合热力学数据及结合常数，结果见图5。图中上半部分的每个峰代表单次滴定相同体积的烟碱至苯甲酸溶液产生的热量，下半部分是烟碱与苯甲酸的结合非线性拟合图，根据拟合曲线得出相应的实验结果列于图中。由实验结果可知，烟碱与苯甲酸的结合位点数n=0.995，约等于1，因此两者的结合比例为1 : 1，验证了此前Job’s Plot 法得到的结合比例实验结果。ΔH= -26.8 KJ/mol 为负值，表明烟碱与苯甲酸的结合是放热的，并且两者之间的作用力为非共价键作用力。ΔG 的负值证实了反应的自发性，负ΔH 和正ΔS表明在两者结合过程中存在疏水作用和静电作用。烟碱与苯甲酸的结合常数Ka=9.021×105M-1，解离常数Kd=1.109×10-6M。

2.5 烟碱与苯甲酸结合能的分子建模计算

烟碱与苯甲酸的结合能可以通过公式：E=ENB-（EN+EB）计算。其中，E 为烟碱与苯甲酸的结合能，ENB 为烟碱苯甲酸复合物的能量，EN、EB 为烟碱，苯甲酸单体的能量。在Gaussian 09 软件中使用B3LYP/6-31G（d, p）方法进行结构优化，频率、热力学性质和能量的计算，见图6。通常情况下，基组重叠误差BSSE 都会过高的估算相互作用能，所以进行零点能校正非常重要，BSSE 的计算是用Boys-Bernardi 的CP 方法。由计算所得原始结合能为-21.86 Kcal/mol，经校正后的结合能为-18.64 Kcal/mol。

2.6 热重分析

采用热重分析比较烟碱苯甲酸复合物与游离态烟碱热失重过程的差异。从图中可以看出烟碱的主要热失重温度为80℃至180℃之间，在180℃之后烟碱基本挥发完全，热失重曲线趋于平缓，在实验条件下烟碱的失重率为98.31%，最大失重速率温度为175℃。烟碱与苯甲酸结合以后复合物的失重温度要比烟碱高不少，复合物在110℃至230℃之间表现出了一个急剧失重的过程，在230℃之后由于基本挥发完全所以热失重曲线趋于平缓，总的失重率为95.87%，比烟碱低一些，最大失重速率温度为220℃。

图6 B3LYP/6-31G（d, p）优化的烟碱苯甲酸复合物分子结构图Fig. 6 B3LYP/6-31G(d, p) geometry-optimized structure of nicotineenzoic acid complex

图7 烟碱及烟碱苯甲酸复合物的TG，DTG 曲线图Fig. 7 TG and DTG curves of nicotine and nicotineenzoic acid complex

3 讨论

烟碱的分子结构及其pH 特性决定了其可以与无机酸或有机酸结合形成各种复合物，然而两者间的结合比例是不一样的，比如烟碱与硅钨酸可以结合成1 : 1的复合物，而烟碱与酒石酸的结合比例为1 : 2，更有甚者可以通过氢键的形式结合第三个酸分子（例如：烟碱与乙酸）[11]。本文通过Job’s Plot 法及等温滴定量热法精确的测定了烟碱与苯甲酸之间的结合比例为1 : 1，为其在新型烟草制品中的应用明确了比例的基础。在明确结合比例的基础上，通过核磁共振氢谱、红外光谱研究确定了苯甲酸是与烟碱中吡咯环形成酸碱作用，这与吡咯环碱性较强而吡啶环碱性较弱的理论依据是一致的。而两者结合中的热力学数据表明结合过程是自发的放热过程，这也与酸碱结合的特性相一致。从热重分析的结果可以看出，烟碱与苯甲酸的复合物拥有更高的热解温度，这也进一步间接的证明了烟碱与苯甲酸之间存在相互的作用力[12]。

4 结论

通过Job’s Plot 法测定了烟碱与苯甲酸的结合比例为1 : 1，进一步通过核磁共振氢谱、红外光谱确定了烟碱与苯甲酸之间存在相互作用力，并且苯甲酸主要与烟碱中的吡咯环相结合。通过等温滴定量热法再次验证了烟碱与苯甲酸1 : 1 的结合比例，两者的结合是自发的放热过程，其中存在静电作用和疏水作用，通过数据拟合得出两者间的结合常数Ka=9.021×105M-1。通过理论计算得出两者的修正结合能E= -18.64 Kcal/mol，热重分析表明烟碱苯甲酸复合物有更高的热解温度。

致谢：本文中分子建模计算得到了华东理工大学马骧教授课题组的大力支持。